Hiperpermeabilitate vasculară dependentă de Src, mediată de neutrofile și modificarea β-cateninei americane

1 Departamente de Chirurgie și Fiziologie Medicală, Institutul de Cercetări Cardiovasculare, Centrul de Științe ale Sănătății Sistemului Universitar A&M din Texas, Temple, Texas 76504

Abstract

endoteliul vascular servește ca o barieră eficientă pentru a controla trecerea transvasculară a substanțelor dizolvate, a fluidelor și a celulelor sanguine. Modificările funcției de barieră sunt implicate în trombogeneză, angiogeneză, inflamație și leziuni de ischemie-reperfuzie. Legarea agoniștilor și a celulelor inflamatorii de celulele endoteliale determină o multitudine de evenimente de semnalizare intracelulară, care pot duce la o creștere a permeabilității endoteliale (12, 19, 30, 34). Interacțiunea cu actomiozină generează forțe contractile care îndepărtează celulele endoteliale strâns legate, ducând la efluxul macromolecular. O proteină adezivă transmembranară numită endotelial vascular (VE) -cadherină formează joncțiuni endoteliale aderente (AJ) care inhibă scurgerea paracelulară a macromoleculelor. Când echilibrul dintre aceste forțe adezive și contractile este modificat, apar disfuncții de barieră și scurgeri.

Studiile anterioare au arătat că un grup de celule inflamatorii, leucocitele polimorfonucleare (PMN), aderă și migrează prin endoteliu în țesuturile înconjurătoare la locurile de leziune sau inflamație și că acest proces este asociat cu permeabilitatea crește (1, 2, 35). Am demonstrat că hiperpermeabilitatea indusă de PMN are loc concomitent cu o creștere a fosforilării tirozinei a VE-cadherinei și β-cateninei, un membru important al unei familii de proteine care leagă complexul cadherin de citoscheletul de actină (14, 16, 27). Recent, studiile au arătat o legătură aparentă între β-catenina și tirozin kinazele familiei Src (Src) (17). Se știe că kinazele Src joacă un rol în semnalizarea transducției disfuncției barierei endoteliale și a angiogenezei (9, 13, 15, 24). Activitatea Src este reglementată de fosforilarea tirozinei la Tyr416, care reglează în sus kinaza, și Tyr527, ceea ce face ca Src să fie mai puțin activ (24).

Produse chimice și medicamente.

Substanțele chimice utilizate au fost C5a recombinant uman și oxid de fenilarsină (PAO; Sigma), SRCi și PP1 (Calbiochem), anti-Src policlonal și anti-β-catenin policlonal (Santa Cruz), antifosfo-Src policlonal (Tyr416) și ( Tyr527) (Semnalizare celulară) și antifosfotirozină policlonală (Transducție). SRCi [Ac-Tyr (PO3H2) -Tyr (PO3H2) -Tyr (PO3H2) -Ile-Glu-OH] concurează pentru legarea la domeniile SH2 (31). Peptida de control negativă a fost [Ac-Asp-Ser (PO3H2) -Thr (PO3H2) -Val-Ser (PO3H2) -OH].

Izolarea și perfuzia microvaselor.

Analize de celule endoteliale.

Izolarea neutrofilelor.

Neutrofilele porcine (PMN) au fost izolate așa cum s-a descris anterior (27). Pentru activare, PMN-urile au fost expuse la C5a recombinant uman (10-8 M). În preparatele izolate de venulă, PMN-urile au fost adăugate la baia de suflare și, în cazul studiilor HUVEC, au fost adăugate direct pe monostrat, în ambele cazuri la o concentrație de 10 6/ml. Studiile anterioare au arătat că C5a afectează funcția endotelială prin căi dependente de neutrofile, dar nu afectează permeabilitatea de la sine (27).

Transfectia proteinelor.

Pentru a transfecta venulele cu SRCi, vasele au fost perfuzate timp de 1 oră cu peptida la 10 μg/ml în prezența reactivului de transfecție a poliaminei TransIT-LT1 (PanVera) la 10 μl/ml. Studiile anterioare de transfecție folosind proteine fluorescente verzi și diferite peptide inhibitoare au arătat că aceasta este o modalitate adecvată de a introduce proteine / peptide în microvase intacte (28). În plus, TransIT-LT1 singur nu are efecte aparente asupra permeabilității sau vasoreactivității microvasculare (28). Pentru transfecția HUVEC, SRCi și TransIT-LT1 au fost adăugate la mediul celular la aceleași concentrații și transfecția a fost lăsată să continue timp de 1 oră. Studiile anterioare au arătat transfecția cu succes a proteinelor celulelor endoteliale folosind această tehnică (26).

Analiza datelor.

În studiile de imunoblot, a fost selectată o imagine reprezentativă a Western blot. Au fost efectuate cel puțin trei repetări pentru fiecare intervenție, iar densitățile optice ale benzilor de proteine au fost calculate în medie. Analiza varianței a fost utilizată pentru a evalua semnificația diferențelor intergrupale în analizele imunoblot și studiile de permeabilitate. O valoare de

FIG. 1.Hiperpermeabilitatea venulară indusă de leucocitele polimorfonucleare (PMN). Venulele au fost perfuzate cu soluție de sare fiziologică a albuminei (APSS), iar coeficientul de permeabilitate bazală al albuminei (Pa) a fost determinat pe o perioadă de 1 oră (prima bară din fiecare grup). Rezultatele sunt exprimate ca procentaj bazal. Tratamentele au fost după cum urmează: A: PMN porcin neactivat (10 6/ml),: C5a (10 −8 M), c: C5a a activat PMN, d: SRCi transfectat timp de 1 oră urmat de PMN activat C5a, e: peptida martor negativ transfectată timp de 1 oră urmată de PMN activat cu C5a, f: PP1 (10-6 M) urmat de PM5 activat C5a și g: DMSO (0,05%) urmat de PM5 activat C5a. Valorile sunt medii ± SE. * Creșterea semnificativă a permeabilității bazale,

Hiperpermeabilitatea indusă de PMN în celulele endoteliale cultivate.

Pentru a determina că răspunsul de permeabilitate al monostratelor de celule endoteliale este în acord cu cel al venulelor intacte, HUVEC-urile au fost expuse la PMN-uri activate după transfecție cu SRCi sau peptidă de control negativ sau expunere la PP1. Așa cum se arată în Fig.2, PMN-urile activate au indus răspunsuri semnificative de hiperpermeabilitate peste nivelurile de control. În plus, supernatantul obținut după ce PMN-urile activate au fost centrifugate a avut un efect similar asupra permeabilității (Fig. 2c). Cu toate acestea, SRCi a abolit complet aceste creșteri ale permeabilității (Fig. 2e). Transfecția peptidei martor negativ nu a blocat hiperpermeabilitatea indusă de PMN (Fig. 2g). În acord cu efectele SRCi, PP1 a blocat și hiperpermeabilitatea indusă de PMN (Fig. 2eu), în timp ce vehiculul DMSO nu a avut niciun efect (Fig. 2k).