Himerele funcționale p53 care conțin virusul Epstein - Barr repetă Gly-Ala sunt protejate de Mdm2-

Editat de Peter M. Howley, Harvard Medical School, Boston, MA și aprobat la 16 noiembrie 2001 (primit pentru revizuire la 18 iunie 2001)

Abstract

Inactivarea funcțională a proteinei supresoare tumorale p53 prin ubiquitină accelerată/proteoliză dependentă de proteazom este un eveniment frecvent în progresia tumorii. Degradarea proteazomală este inhibată de repetarea Gly-Ala (GAr) a antigenului nuclear 1 al virusului Epstein-Barr, care acționează ca un element transferabil pe o varietate de substraturi proteazomale. Demonstrăm că himerele p53 care conțin domenii GAr de diferite lungimi și poziții în cadrul proteinei sunt protejate de proteoliză indusă de ubiquitin ligases dublu minut 2 murin și proteine asociate E6, dar sunt încă ubiquitinate și păstrează capacitatea de a interacționa cu legarea ubiquitinei S5a subunitate a proteazomului. Chimerele GAr transactivează genele țintă p53, induc oprirea ciclului celular și apoptoza și prezintă activitate inhibitorie a creșterii îmbunătățită în celulele tumorale cu activitate p53 endogenă afectată.

Inactivarea p53 de către niveluri ridicate de Mdm2 sau HPV E6 oferă un avantaj clar de creștere in vivo (13, 14), sugerând că o proteină p53 activă terapeutic ar trebui să reziste activității acestor ligase. În acest context, ar trebui subliniat faptul că Mdm2 și E6-AP aparțin unor familii distincte de ubiquitin ligase (15). Mdm2 s-a dovedit recent a fi o ubiquitin ligază RING-deget care se leagă de domeniul de transactivare transcripțională a p53 (16). În schimb, E6-AP interacționează cu domeniul de legare a ADN-ului și este exemplul clasic al domeniului HECT (omologie la capătul terminal E6-AP C) ubiquitin ligază (6). Aceste diferențe explicite între cele două ligase implică faptul că salvarea simultană a p53 din degradarea mediată de E6 și Mdm2 poate fi realizată numai prin țintirea evenimentelor comune din aval în calea degradării.

O oportunitate interesantă pentru atingerea acestui obiectiv poate fi oferită de un modulator recent descoperit al proteolizei dependente de ubiquitină, repetarea Gly-Ala (GAr) a antigenului nuclear 1 al virusului Epstein - Barr (EBV) (EBNA1). Acest domeniu proteic interferează cu procesarea proteazomală a EBNA1 (17), prelungind timpul său de înjumătățire și abrogând prezentarea epitopilor EBNA1 la limfocitele T CD8 + limitate CD8 + complex complex de histocompatibilitate majoră (18, 19). GAr acționează ca un element transferabil cu acțiune cis pe diferite substraturi proteazomice (17, 20). Promiscuitatea efectului implică faptul că GAr poate contracara activitatea unei largi varietăți de ubiquitină ligase, oferind astfel un instrument atractiv pentru reglarea proteolizei multor substraturi de potențial interes pentru terapia de transfer genetic (21).

Aici raportăm despre generarea unui set de himere p53-GAr care prezintă o rezistență îmbunătățită la degradarea indusă de Mdm2 și E6 în testele de cotransfecție și în liniile celulare tumorale umane cu proteoliză accelerată a p53 endogen. Chimerele p53-GAr sunt salvate eficient de degradarea dependentă de ubiquitină/proteazom, rezultând niveluri crescute în starea de echilibru de p53 activ funcțional.

Materiale și metode

Construirea chimerelor p53-GAr.

Cultura țesuturilor, transfecția și testarea formării coloniilor.

Liniile osteosarcomului uman Saos-2 [p53 nul (26),] și U2OS [p53 de tip sălbatic, supraexpresie Mdm2 (13)], și liniile de carcinom cervical uman HeLa (p53 de tip sălbatic, HPV18 pozitiv), CasKi și SiHa [P53 de tip sălbatic, HPV16 pozitiv (14, 27)] au fost menținute în mediul Dulbecco modificat de Iscove (Life Technologies, Grand Island, NY) suplimentat cu 10% FCS. Transfecțiile tranzitorii ale monostratelor subconfluente au fost efectuate cu Lipofectamină (Life Technologies). Pentru testele de formare a coloniilor, 1,9105 celule U2OS transfectate au fost împărțite la 16 ore după transfecție (8000 de celule pe godeu) în mediu conținând 0,5 mg/ml de Geneticin (Sigma). Numărul de colonii viabile a fost numărat după 2 săptămâni de selecție.

Analiza Western Blot.

Extractele de celule totale au fost fracționate prin SDS/PAGE, transferate la membranele nitrocelulozice Protran BA85 (Schleicher & Schuell) și testate cu anticorp monoclonal primar anti-p53 de șoarece (D07, Dako) sau anticorp monoclonal anti-p21 WAF/CIP1 de șoarece (Transduction Laboratories ), Lexington, KY). După incubare cu anticorpii secundari conjugați cu peroxidază, complexele au fost vizualizate prin chemiluminescență sporită (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech). Pentru determinarea volumului de proteine, celulele transfectate transitoriu au fost incubate cu cicloheximidă (Sigma). Densitometria a fost efectuată folosind un Densitometru personal SI (dinamică moleculară).

Citometrie de flux și imunocitochimie.

Analiza citometrică de flux a fost efectuată utilizând un citometru de flux FACSort (Becton Dickinson) și un software cellquest. Pentru analiza ciclului celular, celulele au fost fixate și colorate cu anticorpul anti-p53 de șoarece D07 și un anticorp anti-șoarece marcat cu FITC (Dako) prin utilizarea kitului Cytofix/Citoperm (PharMingen) înainte de incubare cu iodură de propidiu (Sigma). Pentru colorarea imunofluorescentă, celulele au fost fixate în paraformaldehidă 4% și apoi incubate peste noapte cu un anticorp monoclonal anti-FLAG de șoarece (M5, Sigma).

Testele glutatione S-Transferază (GST) Pull-Down.

ORF-urile S5a și S8 au fost amplificate PCR dintr-o bibliotecă de ADNc leucocitar uman (CLONTECH) și clonate în pGEX-5X-1 (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech). Proteinele de fuziune GST-S5a și S8 au fost purificate din tulpina Escherichia coli BL-21 (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech). Celulele HeLa transfectate tranzitoriu cu FLAG p53 sau FLAG p53-GA239/C au fost lizate la 4 ° C timp de 12 ore în tampon de liză (1% digitonină/50 mM NaCl/50 mM Tris, pH 7,6) conținând amestec de inhibitori de protează (Sigma) și 20 mM N-etilmaleimidă (Sigma). Lizatele au fost eliminate prin centrifugare timp de 20 minute la 4 ° C, 15.000 × g și diluate în tampon de legare (50 mM Tris, pH 7,6/50 mM NaCL/0,01% Triton X-100/10% glicerol). Două micrograme de proteină de fuziune GST au fost imobilizate pe 10 pl de gel de glutation Sefaroză 4B (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech) și incubate cu lizate de celule HeLa. După spălare de cinci ori la 4 ° C în tampon de legare, probele au fost resuspendate în tampon de probă SDS pentru separare prin SDS/PAGE și imunoblotare cu anticorpul anti-p53 D07.

Rezultate

Exprimarea chimerelor p53-GAr.

Un set de himere care conțin GAr a fost construit pentru a investiga efectul repetării asupra cifrei de afaceri și funcției proteinei supresoare tumorale p53. Un GAr de 239-aa-lung, derivat dintr-un izolat EBV natural (28), a fost introdus la capătul C al p53 (Fig. 1A). În plus, a fost introdus un GAr mai scurt de 25-aa-lung sau o întindere de glicină de 25-aa-lung mai mică la capătul N sau C al p53.

Exprimarea himerelor p53-GAr în celulele Saos-2 p53-negative. (A) Reprezentarea schematică a himerelor p53 marcate cu FLAG (F) care conțin inserții GAr sau GGr terminale N sau C. (B) Extractele de celule Saos-2 transfectate tranzitoriu au fost examinate prin Western blot cu un anticorp monoclonal specific pentru p53 de tip sălbatic. Sunt indicați markerii greutății moleculare.