Glutenul de grâu digerat inhibă legarea dintre leptină și receptorul său BMC Biochimie Text integral
Abstract
fundal
Rezistența la leptină este considerată un factor primar de risc pentru obezitate. S-a emis ipoteza că proteinele din cerealele din dietă ar putea provoca rezistența la leptină prin împiedicarea legării leptinei de receptorul său. Proteina din grâu dietetică nedegradată a fost găsită în serul uman la un nivel mediu de 41 ng/ml. Aici, raportăm concluziile noastre de la testarea dacă glutenul digerat enzimatic din grâu împiedică legarea leptinei de receptorul leptinei in vitro.
Glutenul din grâu a fost digerat cu pepsină și tripsină în condiții fiziologice. Activitatea de pepsină și tripsină a fost îndepărtată din digestia de gluten cu un filtru de rotire de 10 kDa sau prin tratament termic la 100 ° C timp de 30 de minute. Legarea la receptorul de leptină al leptinei amestecat cu digestia glutenului la o serie de concentrații a fost măsurată folosind tehnologia de rezonanță a plasmonului de suprafață.
Rezultate
Legarea digestiei glutenului la receptorul leptinei nu a fost detectată. Digestia de gluten filtrată prin rotire a inhibat legarea leptinei de receptorul de leptină, cu o inhibare de 50% la o concentrație de digestie a glutenului de
10 ng/ml. Digestia cu gluten tratată termic nu a inhibat legarea leptinei.
Concluzii
Glutenul de grâu digerat inhibă legarea leptinei de receptorul leptinei, cu inhibare la jumătate maximă la 10 ng/ml. Inhibarea este semnificativă la concentrații relevante din punct de vedere clinic și, prin urmare, ar putea servi ca o cale nouă de investigare pentru a înțelege baza moleculară a rezistenței la leptină, a obezității și a tulburărilor asociate.
fundal
Leptina este o polipeptidă de 16 kDa secretată de țesutul adipos alb în circulație, după cum a fost revizuită recent de Zhou și colab. [1]. Nivelurile de leptină în circulație sunt proporționale cu masa de grăsime corporală și fluctuează în conformitate cu modificările stărilor nutriționale. Concentrația de leptină servește ca un semnal cheie de adipozitate pentru creier, unde leptina se leagă și activează receptorul de leptină. Leptina este importantă în reglarea sațietății, a greutății și a homeostaziei energetice. Majoritatea pacienților obezi au niveluri ridicate de leptină circulantă, indicând o stare dobândită de rezistență la leptină, definită de capacitatea redusă a leptinei de a suprima pofta de mâncare și creșterea în greutate [2]. Rezistența la leptină este considerată un factor de risc primar pentru patogeneza supraponderalității și a obezității [2], care la rândul său este strâns asociată cu diferite tulburări metabolice, inclusiv dislipidemie, boli cardiovasculare, accident vascular cerebral, rezistență la insulină și diabet de tip 2. Au fost propuse mai multe mecanisme pentru a explica rezistența la leptină, inclusiv transportul afectat al leptinei, semnalizarea leptinei și circuitele neuronale orientate către leptină [2].
În acest studiu, am testat ultima propoziție a ipotezei de mai sus, care este că proteinele din cereale din boabe inhibă legarea leptinei. Proteinele din cereale din cereale s-au raportat deja că se leagă de un receptor de către Lammers și colab., care au descoperit că peptidele din cereale derivate din digestia enzimatică a gliadinei de grâu cu enzimele intestinale pepsină și tripsină în condiții fiziologice se leagă de receptorul de chemokină CXCR3 exprimat în epitelii și laminee proprii intestinale de șoarece și uman, ducând la eliberarea zonulinelor și la permeabilitatea intestinală crescută [11 ]. Kamikubo și colab. a raportat că aglutinina germenilor de grâu se leagă de receptorul leptinei in vitro și inhibă legarea leptinei de receptorul leptinei [12]. Aglutinina din germeni de grâu se găsește în făina de grâu comun, dar nu și în sângele uman [13]. Am ales să examinăm proteinele din cereale din grâu, care este principala sursă de proteine vegetale din alimentele umane. Principala componentă proteică a grâului este glutenul, care este masa coezivă și elastică care rămâne după ce amidonul a fost îndepărtat din făina de cereale prin clătire cu apă. Mai precis, glutenul din grâu este un compozit din mai multe tipuri de proteine, cum ar fi gliadinele (greutatea moleculară
30 kDa) și glutenine (greutate moleculară
30-90 kDa). Aportul de gluten a crescut foarte mult în ultimele sute de ani și s-a accelerat în ultimele decenii [14,15]. Această creștere se datorează în mare parte creșterii soiurilor de cereale bogate în gluten și, mai recent, prin utilizarea glutenului suplimentar la coacere și procesarea alimentelor pentru a face aluatul mai ușor de lucrat și pentru a face pâinea mai pufoasă [15]. Soares și colab. a constatat că o dietă fără gluten reduce leptina, adipozitatea, inflamația și rezistența la insulină la șoareci, în ciuda unui aport energetic similar [16]. Chirdo și colab. a raportat prezența gliadinei de grâu nedegradate în serul uman (la un nivel mediu de 41 ng/ml) [17], așa cum a fost raportat anterior și pentru alte proteine dietetice de către Husby și colab. [18.19].
Aici, am folosit tehnologia de rezonanță plasmonică de suprafață (SPR) pentru a monitoriza interacțiunea dintre leptină și receptorul de leptină și inhibarea acesteia de gluten digerat enzimatic din grâu.
Metode
Digestia glutenului
Pentru a imita condițiile fiziologice din intestinul uman, glutenul din grâu a fost digerat conform protocolului De Ritis și colab. [20] cu ușoare modificări. 100 g de gluten din grâu (Sigma-Aldrich: G5004) au fost digerate în 1 L de HCI 0,2 N (pH 1,8) conținând 2 g de pepsină (Sigma-Aldrich: P6887) la 37 ° C timp de 2 ore. PH-ul a fost verificat periodic și ajustat la 1,8 cu HC1 sau NaOH, după cum este necesar. PH-ul a fost apoi ajustat la 8,0 cu NaOH 2 N. Glutenul digerat cu pepsină a fost digerat în continuare prin adăugarea a 2 g de tripsină (Sigma-Aldrich: T4799). Glutenul rezultat digerat cu pepsină și tripsină a fost agitat energic la 37 ° C timp de 4 ore. PH-ul a fost verificat periodic și ajustat la pH 8,0 cu HC1 sau NaOH, după caz.
Îndepărtarea pepsinei și a tripsinei
Pepsină (greutate moleculară
40 kDa) și tripsină (greutate moleculară
25 kDa) au fost îndepărtate din digestia de gluten fie prin filtrare prin rotire printr-un filtru de 10 kDa, fie prin tratament termic la 100 ° C timp de 30 min urmat de centrifugare la 13000 g timp de 10 min. Concentrația de digestie a glutenului după filtrare sau centrifugare a fost determinată din absorbanță la 280 nm, presupunând o absorbanță de 1 la 1 mg/ml. Pentru a verifica dacă a rămas vreo activitate de pepsină sau tripsină, 1,8 μg/mL de leptină (leptină umană recombinată, sisteme de cercetare și dezvoltare) a fost incubată în digestie cu gluten (numai filtrare prin rotire sau filtrare prin rotire și tratare termică) timp de 1 oră sau 24 ore ° C Probele au fost rezolvate prin SDS PAGE (Invitrogen) și au fost șterse folosind iBlot® Gel Transfer Stacks, PVDF, mini kit (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. După spălare, petele au fost incubate cu anticorp conjugat cu anti-leptină HRP (HyTest Ltd, nr. Cat. 2LE1C) la 4 ° C peste noapte. Anticorpul a fost utilizat la o diluție de 1: 1000 în raport cu concentrația stoc în produs (HyTest Ltd, nr. Cat. 2LE1C). Benzile imunoreactive au fost detectate folosind reactivi ECL (GE Healthcare Life Sciences).
Studii SPR
Datele fazei de disociere au fost adaptate folosind o singură descompunere exponențială:
Valoarea obținută pentru k off a fost apoi utilizată în timpul adaptării datelor fazei de asociere pentru a obține o estimare a k on cu următoarea ecuație:
Datele de inhibare au fost analizate prin găsirea valorii platoului la sfârșitul fiecărei injecții de leptină singură sau leptină plus gluten.
Rezultate
Îndepărtarea pepsinei și a tripsinei
Western blot a arătat benzile de leptină rămase pentru toate digestile de gluten după atât 1, cât și 24 de ore. Acest lucru arată că filtrarea prin rotire și tratamentul termic au eliminat toate activitățile de protează din digestia glutenului, deoarece altfel leptina ar fi fost degradată.
Studii SPR
Analiza SPR a legării leptinei la receptorul de leptină și inhibarea acesteia de către digestia glutenului. A) Exemple de sensorgrame înregistrate în timpul injecției cu 30 nM de leptină singură (neagră) sau în prezența 0,0022 (albastru), 0,0045 (verde), 0,018 (portocaliu) sau 0,3 (roșu) μg/ml gluten digerat pe un senzor Chip cu imobilizat receptorul leptinei-himera Fc. Linia punctată roz se potrivește cu linia neagră folosind ecuația 2 (vezi Metode). B) Exemplu de sensorgramă înregistrată în timpul fluxului tampon după injectarea completă de 30 nM leptină (neagră). Linia punctată roz se potrivește cu datele folosind ecuația 1 (vezi Metode). Cele două linii verticale apar în timpul disocierii prelungite când mașina comută între cele două pompe ale sale. C) Grafic de intensitate relativă la platoul final de legare a leptinei în timpul injectării de 30 nM leptină versus concentrația de digestie a glutenului. Barele de eroare reprezintă abaterea standard a trei măsurători.