Formarea corpului mallor indus de acidul biliar în ficatul șoarecelui cu tratament medicamentos
Peter Fickert
De la Departamentele de Medicină * și Patologie, † Universitatea Karl-Franzens, Graz, Austria
Michael Trauner
De la Departamentele de Medicină * și Patologie, † Universitatea Karl-Franzens, Graz, Austria
Andrea Fuchsbichler
De la Departamentele de Medicină * și Patologie, † Universitatea Karl-Franzens, Graz, Austria
Conny Stumptner
De la Departamentele de Medicină * și Patologie, † Universitatea Karl-Franzens, Graz, Austria
Kurt Zatloukal
De la Departamentele de Medicină * și Patologie, † Universitatea Karl-Franzens, Graz, Austria
Helmut Denk
De la Departamentele de Medicină * și Patologie, † Universitatea Karl-Franzens, Graz, Austria
Abstract
Recent am demonstrat că hrănirea obstructivă a colestazei sau acidului colic (CA) duce la supraexprimarea CK însoțită de fosforilare anormală în ficatul șoarecelui; Cu toate acestea, relația de cauzalitate dintre colestază cu reținerea acizilor biliari potențial toxici și formarea MB a rămas neclară. Acest studiu a fost conceput pentru a clarifica dacă colestaza și acizii biliari reprezintă singuri factori cauzali în formarea MB. Prin urmare, am evaluat influența colestazei obstructive prin ligarea comună a căilor biliare (CBDL) și hrănirea CA (pentru a imita retenția unui acid principal biliar primar) asupra formării citoscheletului IF și MB într-un model de șoarece experimental bine definit (adică, medicamentul -ficat de șoarece amorsat). 2,4,18-21 Se raportează dovezi că colestaza și acizii biliari joacă un rol central în formarea MB.
Materiale și metode
Animale
Șoarecii masculi albini elvețieni (tulpina Him OF1 SPF) au fost obținuți de la Institutul de Cercetare Animală de Laborator, Facultatea de Medicină a Universității din Viena, Himberg, Austria, găzduită cu un ciclu lumină-întuneric de 12:12 ore și a permis consumul ad libitum de apă și o dietă standard pentru șoareci (Marek, Viena, Austria). Experimentele au fost efectuate cu șoareci de 2 luni cu greutatea de 25 până la 30 g. Experimentele au fost aprobate de comitetul local de etică și au urmat criteriile prezentate în Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator pregătit de Academia Națională de Științe a Statelor Unite, publicat de Institutul Național de Sănătate (publicația NIH 86-23, revizuit 1985). CA și DDC au fost obținute de la Aldrich (Steinheim, Germania).
Intoxicarea DDC
Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă care conțin 0,1% DDC timp de 2,5 luni pentru a induce MB. 2,4 După această perioadă de timp, un grup de animale a fost sacrificat pentru a evalua modificările cito-scheletice induse de DDC, inclusiv formarea MB, în timp ce un alt grup a fost sacrificat la 4 săptămâni după întreruperea alimentării cu DDC pentru a studia reversibilitatea acestor modificări, așa cum a fost descris anterior. 4 În plus, șoarecii amorsați recuperați au primit o dietă conținând 0,1% DDC timp de 7 zile sau supuși hranei cu CBDL sau CA (a se vedea Figura 1 ▶ pentru proiectarea experimentală).
Proiectare experimentală pentru a studia rolul colestazei și al acizilor biliari în formarea MB la șoarecii pregătiți de medicamente. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă de control sau cu 0,1% dietă suplimentată cu DDC timp de 2,5 luni pentru a induce MB. Un grup de animale a fost sacrificat pentru a studia modificările cito-scheletice induse de DDC (inclusiv formarea MB), în timp ce un alt grup a fost sacrificat la 4 săptămâni după întreruperea alimentării cu DDC (recuperare) pentru a evalua reversibilitatea acestor modificări. În plus, șoarecii recuperați (amorsați) au primit dietă de control (Co) sau au fost supuși alimentării cu DDC (DDC), hrănirii cu CBDL, CA și, respectiv, operației simulate timp de 7 zile, respectiv. Cinci animale au fost studiate în fiecare grup.
Toate procedurile chirurgicale au fost efectuate în condiții sterile. Pentru a studia efectele colestazei obstructive asupra expresiei CK și a formării MB la șoareci pregătiți de medicament, conducta biliară comună a fost ligată aproape de hilul hepatic imediat sub bifurcație și disecată între ligaturi așa cum s-a descris anterior. 23 În plus, colecistectomia a fost efectuată după ligarea canalului chistic. Controalele au suferit o operație falsă cu expunere, dar fără ligarea căii biliare comune și îndepărtarea vezicii biliare. Ficatele au fost excizate sub anestezie generală (10 mg Avertin i.p.) la 7 zile după operație. Probele de țesut hepatic au fost înghețate în azot lichid pentru analize moleculare și microscopie de imunofluorescență sau fixate în soluție de formaldehidă tamponată neutră 4% pentru microscopie ușoară și imunohistochimie. Probele de ser de la fiecare șoarece au fost depozitate la -70 ° C pentru analiza aspartatului aminotransferazei/alaninei aminotransferazei, a fosfatazei alcaline și a nivelurilor totale de acid biliar.
Hrănirea cu acid biliar
Pentru a studia efectele acizilor biliari asupra expresiei CK și formării MB, șoarecii pregătiți de medicamente au fost hrăniți cu o dietă suplimentată cu CA (1%) timp de 7 zile. 22.24 Ficatele și serurile au fost prelucrate așa cum s-a descris mai sus.
Determinarea numerelor de copiere a ARNm
Numerele de copii ale ARNm pentru CK 8, CK 18 și gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază au fost determinate prin reacție în lanț competitivă cu transcriptază inversă-polimerază. 10
Western Bloting pentru CK 8 și CK 18
Nivelurile de proteine CK 8 și CK 18 au fost determinate prin analiza Western blot. 4.22
Microscopie de imunofluorescență
Microscopia de imunofluorescență a fost efectuată pe secțiuni hepatice înghețate (3-μm grosime, fixate în acetonă la -20 ° C timp de 10 minute) folosind anticorpul monoclonal MM120-1 recunoscând în mod specific MBs și anticorpul policlonal CK 50K160 de iepure împotriva CK 8 și CK 18 ca descris anterior. 4,22,25 În plus, fosforilarea CK 8 a fost evaluată cu anticorpul 5B3 împotriva unui epitop hiperfosforilat al CK 8. 4,26 Imunomarcare dublă a fost efectuată combinând anticorpii monoclonali MM120-1 sau 5B3 cu anticorpul policlonal 50K160. Ca anticorpi secundari, s-au folosit IgG capră anti-șoarece conjugată cu Cy2 (Amsersham, Buckinghamshire, Marea Britanie) și Ig anti-iepure porcine conjugate cu tetrametilrhodamină isotiocianat (DAKO, Glostrup, Danemarca). Pentru control, anticorpii primari au fost permiși sau înlocuiți cu imunoglobuline potrivite cu izotip (DAKO). Probele imunofluorescente au fost analizate cu un dispozitiv confocal de scanare laser MRC 600 (Bio-Rad, Richmond, CA) atașat la un microscop Zeiss Axiophot. Imaginile fluorescente au fost colectate folosind tubul fotomultiplicator confocal la cadru complet 768 × 512 pixeli).