Ezetimibul și Simvastatina reduc nivelul colesterolului în larvele de pește zebră care alimentează o dietă bogată în colesterol
1 Departamentul de Medicină, Universitatea din California, San Diego, La Jolla, CA 92093, SUA
Abstract
1. Introducere
În 2009, am sugerat, pentru prima dată, să folosim peștele zebră ca organism model pentru a studia evenimente vasculare specifice relevante pentru dezvoltarea aterosclerozei umane [1]. Hrănirea peștilor zebra adulți cu o dietă bogată în colesterol (HCD) are ca rezultat hipercolesterolemie, colesterolul plasmatic total atingând 800 mg/dL, oxidarea profundă a lipoproteinelor și formarea de leziuni vasculare, asemănătoare dungilor de grăsime umane. Peștele zebră adult hrănit cu HCD a fost folosit de Cho și colegii săi pentru a studia efectele suplimentelor alimentare și îndulcitorilor asupra nivelului de colesterol plasmatic și asupra activității CETP [2-4]. Transparența optică a larvelor de pește zebră în primele 30 de zile după fertilizare (dpf) permite monitorizarea microscopică la animalele vii a acumulării de lipide vasculare, recrutarea celulelor mieloide, formarea celulelor de spumă macrofagă, dezorganizarea stratului de celule endoteliale și creșterea PLA2 vasculară activitate și permeabilitate vasculară - toate induse de o hrănire scurtă (5-14 zile) cu HCD [1, 5]. Mai mult, raportul nostru recent demonstrează aplicațiile unui transgenic hsp70: IK17-EGFP pește zebră, cu expresie condiționată a anticorpului conjugat EGFP IK17 specific LDL oxidat, în studiu in vivo oxidarea lipoproteinelor și în testarea efectelor terapeutice ale antioxidanților [5].
Deoarece hrănirea peștilor zebră cu HCD duce la o oxidare extinsă a lipoproteinelor, am caracterizat în continuare mediul lipidic oxidat în larvele alimentate cu HCD [6]. O hrănire cu HCD de 2 săptămâni a dus la creșteri de până la 70 de ori a nivelurilor de esteri de colesterol oxidați, fosfolipide oxidate și lizofosfolipide în omogenizații de pește zebră. În mod remarcabil, moleculele specifice de lipide oxidate detectate în larvele de pește zebră alimentate cu HCD folosind cromatografie lichidă-spectrometrie de masă au fost identice cu cele găsite în leziunile aterosclerotice umane și de șoareci [6]. Lipoproteinele izolate din larvele alimentate cu HCD au activat macrofagele de șoarece in vitro, cu modelul de fosforilare ERK1/2, JNK și Akt și răspândirea celulară similară cu cea indusă de LDL uman minim oxidat [6].
Astfel, munca noastră și munca altora sugerează că hipercolesterolemia și oxidarea lipoproteinelor obținute în peștele zebră și caracteristicile acumulării lipidelor vasculare și ale proceselor inflamatorii, relevante pentru aterogeneză umană, fac modelul zebră un atractiv in vivo sistem pentru testarea abordărilor terapeutice noi și studierea mecanismelor medicamentelor existente. Scopul prezentului studiu a fost de a investiga dacă simvastatina și ezetimibul, principalele medicamente utilizate pentru gestionarea hipercolesterolemiei la om, ar reduce, de asemenea, nivelul colesterolului în larvele de pește zebră alimentate cu HCD.
2. Materiale și metode
2.1. Întreținerea și hrănirea peștilor zebră
S-au obținut embrioni de pește zebră de tip sălbatic (AB) in vitro fertilizarea și reproducerea naturală a adulților menținută la 28 ° C pe un ciclu de lumină/întuneric de 14/10 ore și etapizată așa cum este descris [7]. Larvele de pește zebră au fost hrănite de două ori pe zi, începând cu a 5-a zi după fertilizare (dpf), fie cu dietă martor (Perle aurii, dimensiune 100-200 mm din Brine Shrimp Direct), fie cu HCD (colesterol 4% dizolvat în dietil eter adăugat la Golden Perle) timp de 14 zile, așa cum este descris în lucrarea noastră anterioară [1]. Toate studiile pe animale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din California, San Diego.
2.2. Tratamentul cu Ezetimibe și Simvastatină
2.3. Extracția lipidelor din omogenate de pește zebră și măsurători ale colesterolului
La sfârșitul perioadei de hrănire/tratament, 20 de larve de pește zebră din fiecare grup experimental au fost eutanasiate prin expunere la 0,05% tricaină (Sigma). Au fost îndepărtate abdomenele care conțin alimente nedigerate, iar corpurile rămase au fost reunite și omogenizate ușor în 200 μL de PBS rece ca gheața într-un tub eppendorf folosind un pistil de plastic. După răsucirea resturilor de țesut, supernatantul reprezentând fluidele corpului a fost utilizat pentru analize suplimentare. Conținutul de proteine din omogenizați a fost determinat folosind testul Bradford cu un kit de testare a proteinei BCA (Pierce). Lipida totală a fost extrasă din omogenatele de pește zebră așa cum am descris anterior [6]. Pe scurt, omogenatele tisulare au fost suplimentate cu 50 μg stigmasterol, un standard intern pentru controlul recuperării sterolilor extrasați. Extracția totală a lipidelor a fost efectuată cu metanol/diclormetan 1: 2. Esterii colesterolului au fost saponificați și colesterolul liber total și stigmasterolul au fost măsurați cu un cromatograf gazos Shimadzu GC-2014 folosind un
(i.d.) ZB-5HT coloană capilară inferioară, grosimea filmului 0,2 μm (Phenomenex). Standardele privind colesterolul și stigmasterolul au fost analizate în paralel cu probele experimentale.
2.4. Statistici
-testul a fost utilizat pentru a analiza diferențele dintre mediile a 2 grupuri.
a fost folosit ca prag de semnificație.
3. Rezultate si discutii
Am raportat anterior că nivelul colesterolului plasmatic la peștele zebră adult crește de la 200 la 800 mg/dL după 12 săptămâni de hrănire cu HCD. Larvele de pește zebră sunt prea mici pentru a extrage sânge. Astfel, am măsurat nivelurile de colesterol din fluidele corporale izolate din larvele din care abdominii au fost îndepărtați și corpurile rămase au fost ușor omogenizate. Omogenatele au fost centrifugate pentru a restrânge resturi de țesut și supernatanții au fost folosiți pentru extragerea lipidelor totale și măsurarea colesterolului utilizând o metodă de cromatografie cu gaze. O hrănire cu HCD de 2 săptămâni a dus la o creștere de 2,5 ori a nivelului de colesterol în larvele de pește zebră (Figura 1). Aceste rezultate sugerează că condițiile experimentale utilizate în experimentele cu larve de pește zebră raportate în lucrările noastre anterioare [1, 5, 6] conduc la creșteri semnificative ale nivelului colesterolului în fluidele corpului larvelor, comparabile cu hipercolesterolemia raportată pentru peștele zebră adult hrănit cu HCD [1].
din 6 experimente independente; 15-20 de larve au fost reunite pentru fiecare punct de date experimentale din fiecare experiment individual.
Pentru a studia efectul simvastatinei, am adăugat-o inițial direct în apă, așa cum a fost raportat în studii pe termen scurt [9]. Cu toate acestea, am constatat că o expunere prelungită la simvastatină în apă a fost toxică pentru larvele de pește zebră. Variația dozelor de simvastatină și a vârstei larvelor la începutul tratamentului nu a contribuit la îmbunătățirea supraviețuirii peștilor zebră. Apoi, am amestecat simvastatina în alimente pentru pești în doze cuprinse între 0,1 și 50 μg pe gram de alimente (μa/a). După cum se estimează în Metode, o doză de, de exemplu, 10 μg/g simvastatină administrată cu alimente de pește zebră este aproximativ un echivalent cu o doză de 50 mg simvastatină administrată pacienților umani. Așa cum se arată în Figura 2, aceste doze de simvastatină au fost mai puțin eficiente decât se așteptau din studiile pe termen scurt, fără nicio diferență semnificativă între grupul care a primit HCD singur și grupul care a primit HCD cu doze mai mari de simvastatină (