Extractul de etanol Syzygium aromaticum reduce obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi la șoareci
CHANG HWA JUNG
1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;
JIYUN AHN
1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;
TAE-IL JEON
1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;
TAE WAN KIM
2 Departamentul de Știința Alimentelor și Biotehnologie, Universitatea Națională Andong, Gyeongbuk 760-749, Republica Coreea
TAE YOUL HA
1 Divizia de Cercetare a Metabolismului și Funcționalității, Institutul de Cercetări Alimentare din Coreea, Seongnam 463-746;
Abstract
Introducere
Excesul de greutate și obezitatea au devenit probleme globale grave în ultimii ani, cu un raport recent care estimează că 1,5 miliarde de adulți din întreaga lume sunt supraponderali, dintre care peste 200 de milioane de bărbați și aproape 300 de milioane de femei sunt obezi (1). Excesul de greutate și obezitatea au fost cândva considerate probleme asociate națiunilor cu venituri ridicate, dar incidența lor crește acum în țările cu venituri mici și medii, o tendință care este atribuită alcoolismului cronic, excesului de consum alimentar și stilului de viață sedentar. Persoanele supraponderale și obeze se confruntă cu riscul numeroaselor boli cronice, inclusiv boli de inimă, diabet și unele tipuri de cancer, precum și probleme psihologice și sociale.
Excesul de greutate și obezitatea, precum și bolile netransmisibile asociate cu dezvoltarea lor, sunt în mare parte prevenibile. Mai mulți pași pot fi luați nu numai la nivel individual și social, ci și la nivel molecular pentru a preveni și trata supraponderalitatea și obezitatea. La nivel individual, indivizii sunt capabili să-și limiteze consumul de grăsimi și zahăr, să mărească consumul de fructe și legume și să se angajeze în activitate fizică regulată. La nivel social, guvernele și industria alimentară pot promova diete sănătoase. La nivel molecular, cercetătorii identifică și/sau dezvoltă agenți care previn sau tratează obezitatea. O cercetare recentă sa concentrat asupra dezvoltării agenților anti-obezitate derivați din produse naturale, un proces care are mai multe avantaje economice și de siguranță față de dezvoltarea produselor farmaceutice prin ani de investiții în dezvoltarea medicamentelor. O astfel de cercetare a fost susținută de rapoartele recente conform cărora extractele tradiționale din plante au fost găsite eficiente în reducerea greutății corporale in vivo (2,3).
Printre aceste extracte, mugurii de flori aromatici uscați ai Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry (familia Myrtaceae), cunoscută sub denumirea de cuișoare, a fost raportată a fi utilă în tratarea durerilor dentare, a cefaleei și a tulburărilor respiratorii în țările asiatice (4). Studiile fitochimice indică faptul că eugenolul, un membru al clasei fenilpropanoide a compușilor chimici și derivații săi, sunt responsabili pentru aroma unică a S. aromaticum și s-a constatat că are antimicrobiene, insecticide, antioxidante, antitumorale, antiinflamatoare și anestezice proprietăți (5-10). În ciuda acestor constatări și rapoarte ale utilității sale în mai multe aplicații medicinale, S. aromaticum nu a fost investigat pentru potențialul său ca agent anti-obezitate sau aditiv alimentar. Prin urmare, studiul de față a investigat efectul extractului de etanol S. aromaticum (SAE) asupra unui model de șoarece în care obezitatea fusese indusă prin administrarea unei diete bogate în grăsimi (HFD).
Materiale și metode
Materiale
Anti-PPARγ (sc-7273), SREBP-1 (sc-366) și CD36 (sc-13572) au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SUA). Anticorpii împotriva FAS (# 3180) și β-actina (# 4967) au fost cumpărați de la Cell Signaling (Danvers, MA, SUA). Insulina (I5500), izobutilmetilxantina (I7018), dexametazona (D4902) și Oil Red O (O0625) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Kituri de trigliceride serice și tisulare (TG), colesterol total (TC) și kituri de lipoproteine-colesterol (HDL-C) de înaltă densitate au fost achiziționate de la Wako Chemicals (Osaka, Japonia). Un kit ELISA pentru insulină a fost obținut de la Shibayagi Co. (Gunma, Tokyo, Japonia). Un kit ELISA pentru leptină a fost achiziționat de la R&D Systems (Minneapolis, MN, SUA).
Pregătirea extractului
Mugurii de flori uscați de Syzygium aromaticum au fost cumpărați de la Omni Herb Company (Seul, Coreea de Sud) și au fost extrasați de trei ori cu 70% etanol la temperatura camerei peste noapte. Extractele au fost combinate și concentrate folosind un evaporator rotativ și liofilizate sub vid și dizolvate în dimetil sulfoxid (DMSO).
Cultura și diferențierea celulară
Celulele 3T3-L1 au fost cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) cu 1% penicilină-streptomicină și 10% ser de vițel bovin la 37 ° C și 5% CO2. Celulele au fost însămânțate la o densitate de 4 × 105 celule/godeu într-o placă cu 6 godeuri. La 2 zile după confluență (ziua 0), celulele au fost expuse la o soluție MDI conținând 0,5 mM de 3-IBMX, 1 μM de dexametazonă și 1 μg/ml de insulină timp de 2 zile în DMEM cu 10% ser fetal bovin ( FBS). După inducție, celulele au fost trecute la o soluție care conține mediu DMEM suplimentat cu 1% penicilină-streptomicină, 10% FBS și 167 nm insulină timp de 2 zile. Celulele au fost menținute într-un mediu postdiferențiat (DMEM conținând 1% penicilină-streptomicină și 10% FBS) și modificate la fiecare 2 zile. Pentru a examina efectele SAE asupra diferențierii preadipocitelor în adipocite, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de SAE la 2 zile după confluență (ziua 0).
Ulei de roșu O colorare
Pentru cuantificare, celulele au fost fixate cu 10% formalină neutră timp de 1 oră la temperatura camerei, spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și apoi colorate timp de 1 oră cu 0,5% ulei roșu O în izopropanol 60%. După spălare cu apă distilată, celulele colorate au fost observate la microscop. Picăturile lipidice colorate au fost apoi extrase cu izopropanol pentru cuantificare prin măsurarea absorbanței sale la 490 nm.
Modele animale
Șoareci masculi C57BL/6J cu vârsta de 4 săptămâni au fost obținuți de la Orient Bio Inc. (Seoul, Coreea de Sud) și aclimatizat la condițiile de laborator constând dintr-un ciclu de lumină-întuneric 12: 12-h, 24 ° C și 55% umiditate timp de 1 săptămână. La vârsta de 5 săptămâni șoarecii au fost apoi împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri; un grup a hrănit dieta Institutului American de Nutriție AIN-76A (grup normal), un grup a hrănit un HFD (grup HFD) și un grup a hrănit un HFD suplimentat cu 0,5% (g/g) SAE (grup HFD + SAE) timp de 9 săptămâni. Dietele experimentale au fost preparate prin completarea dietei de bază AIN-76 cu 20% grăsimi și 0,5% colesterol (g/g). Greutatea corporală și aportul mediu zilnic de alimente au fost măsurate săptămânal. Îngrijirea și utilizarea animalelor au urmat liniile directoare instituționale și naționale și toate procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din Coreea Food Research Institute (KFRI-IACUC, # 2010-0011).
Pregătirea probelor și proceduri
La nouă săptămâni după consumarea dietelor experimentale, șoarecii au fost supuși postului timp de 12 ore și apoi sacrificați. Probele de sânge au fost colectate din aorta abdominală, centrifugate la 1000 × g timp de 15 minute și depozitate la -80 ° C. Măsurarea nivelurilor serice de TG, TC și HDL-C a fost efectuată cu setul adecvat. Măsurarea concentrațiilor serice de insulină și leptină a fost efectuată în conformitate cu instrucțiunile producătorului pentru seturile ELISA de insulină și leptină de șoarece. Țesuturile epididimale, perirenale și hepatice au fost excizate, cântărite și depozitate la -80 ° C până la utilizare. Plăcuțele de grăsime hepatică și epididimală au fost fie fixate în soluție de formalină 4% și prelucrate pentru examinare histologică, fie congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la extracția proteinelor și ARN-ului.
Pentru a determina nivelurile totale de lipide, TG și TC în ficat, ficatul fiecărei grupe a fost omogenizat în 5 ml NaCI. După ce s-au adăugat ulterior 20 ml soluție Folch (cloroform: metanol = 2: 1) la fiecare omogenat, soluția rezultată a fost incubată la 4 ° C timp de 12 ore. Probele au fost centrifugate timp de 10 minute la 1.000 × g înainte ca stratul organic să fie îndepărtat și uscat folosind un Speed Vac. Peleta rezultată a fost dizolvată în alcool etilic conținând 25% Triton X-100 și apoi testată pentru nivelurile de TG, TC și HDL-C folosind truse comerciale indicate.