Extincția fricii afectată din cauza unui deficit de influx de Ca2 prin canalele de Ca2 cu tensiune de tip L
Fabio Morellini
1 Institut pentru biosinteza structurilor neuronale, Centrul pentru Neurobiologie Moleculară Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germania
2 Grup de cercetare Biologie comportamentală, Centrul pentru Neurobiologie Moleculară Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germania
Aleksey Malyshev
3 Departamentul de Neurofiziologie, Universitatea Ruhr Bochum, Bochum, Germania
4 Institutul de activitate nervoasă superioară și neurofiziologie, Academia Rusă de Științe, Moscova, Rusia
Maxim Volgushev
3 Departamentul de Neurofiziologie, Universitatea Ruhr Bochum, Bochum, Germania
4 Institutul de activitate nervoasă superioară și neurofiziologie, Academia Rusă de Științe, Moscova, Rusia
5 Departamentul de Științe Psihologice, Universitatea din Connecticut, Storrs, CT, Statele Unite
Marina Chistiakova
3 Departamentul de neurofiziologie, Universitatea Ruhr Bochum, Bochum, Germania
5 Departamentul de Științe Psihologice, Universitatea din Connecticut, Storrs, CT, Statele Unite
Giorgi Papashvili
1 Institut pentru biosinteza structurilor neuronale, Centrul pentru Neurobiologie Moleculară Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germania
Laetitia Fellini
1 Institut pentru biosinteza structurilor neuronale, Centrul pentru Neurobiologie Moleculară Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germania
Ralf Kleene
1 Institut pentru biosinteza structurilor neuronale, Centrul pentru Neurobiologie Moleculară Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germania
Melitta Schachner
6 Center for Neuroscience, Shantou University Medical College, Shantou, China
7 Keck Center for Collaborative Neuroscience și Departamentul de biologie celulară și neuroștiințe, Universitatea Rutgers, Piscataway, NJ, Statele Unite
Alexandru Dityatev
1 Institut pentru biosinteza structurilor neuronale, Centrul pentru Neurobiologie Moleculară Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germania
8 Grupul de Neuroplasticitate Moleculară, Centrul German pentru Boli Neurodegenerative (DZNE), Magdeburg, Germania
9 Facultatea de Medicină, Universitatea Otto-von-Guericke, Magdeburg, Germania
10 Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS), Magdeburg, Germania
Abstract
Introducere
Tenascin-C (TNC) este exprimat în mod vizibil în diferite țesuturi în timpul dezvoltării. În sistemul nervos central în curs de dezvoltare, TNC este implicat în reglarea proliferării celulelor precursoare ale oligodendrocitelor și a astrocitelor. Expresia TNC este subregulată în creierul adultului, cu excepția zonelor care mențin neurogeneza până la maturitate, cum ar fi hipocampul și hipotalamusul (Wiese și colab., 2012). După vătămare, expresia TNC este reglată în sus în neuronii care răspund la insultă. TNC susține regenerarea măduvei spinării prin promovarea creșterii axonale și a formării sinapselor în măduva spinării caudală la locul leziunii (Yu și colab., 2011).
Afectarea selectivă a LTP indusă de protocoalele care implică activarea L-VGCC la șoareci TNC -/- sugerează că deficiența TNC duce la afectarea expresiei și/sau funcționalității acestor canale, care sunt compuse din 3-4 subunități: poro- formând subunitatea α1 și β auxiliară, precum și subunitățile α2δ și γ (Hofmann și colab., 1994). În creierul mamiferelor, Cav1.2 și Cav1.3 sunt cele două subunități α1 majore ale L-VGCC care constituie o cale importantă de intrare Ca 2+ în neuroni.
Aici, am încercat să legăm mai strâns deficiența observată de LTP la șoareci TNC -/- la o funcție redusă a canalelor de calciu de tip L și la deficitele comportamentale. Arătăm că la șoareci TNC -/-, nivelul de exprimare a celor două subunități L-VGCC α1 nu este scăzut, dar afluxul de Ca 2+ prin L-VGCC este redus semnificativ. Arătăm în continuare o afectare dependentă de L-VGCC în dispariția amintirilor de frică contextuale la șoareci TNC -/-. Concluzionăm că funcționalitatea afectată a L-VGCC poate fi motivul afectării deficienței LTP și a comportamentului la șoarecii TNC -/-.
Materiale și metode
Șoarecii TNC -/- (Evers și colab., 2002) au fost consangvinizați pe fundalul C57BL/6. Masculii TNC -/- și TNC +/+ de sex masculin în vârstă de zece până la doisprezece săptămâni au fost obținuți din reproducerea heterozigotă și au fost ținute sub un ciclu de lumină inversat de 12: 12 h: luminile stinse la 07:00) și condițiile standard de adăpostire (23 ± 1 ° C; 50% umiditate; alimente și apă ad libitum). Testele comportamentale au fost efectuate într-o cameră experimentală adiacentă facilității pentru animale și iluminate cu lumină roșie slabă. Experimentele au fost efectuate în mijlocul fazei întunecate a ciclului. Toate materialele au fost curățate cu apă cu săpun, apă și etanol (75%) între șoareci. Experimentele au fost efectuate în conformitate cu Directiva Consiliului Comunității Europene (86/609/CEE), iar procedurile utilizate au fost aprobate de statul Hamburg. S-a avut grijă să minimizeze durerea sau disconfortul pentru animale.
Analiza expresiei Cav1.2 și Cav1.3
Anticorpii policlonali împotriva subunităților Cav1.2 și Cav1.3 ale L-VGCC au fost furnizați cu amabilitate de R. Westenbroek și W. Catterall și sunt descriși în altă parte (Hell și colab., 1996). Anticorp monoclonal împotriva gliceraldehidei-3-fosfat dehidrogenazei de iepure (GAPDH) a fost obținut de la Chemicon International (Temecula, CA, SUA).
Analiza imunohistochimică a expresiei Cav1.2 și Cav1.3 a fost efectuată așa cum a fost descris de Kochlamazashvili și colab. (2010). Pentru Western blot, hipocampii au fost omogenizați în 200 μl tampon TE (50 mM Tris/HCI, 5 mM EDTA, pH 8). După determinarea concentrației de proteine folosind testul BCATM Protein (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA), 50 μg proteine pe bandă au fost supuse SDS-PAGE pe 10% geluri urmate de analiza Western blot. Proteinele au fost transferate într-o membrană de nitroceluloză (Protran, Schleicher și Schuell, Dassel, Germania), iar membrana a fost blocată cu lapte praf uscat fără grăsimi 5% în PBS, pH 7,5. Membrana a fost incubată cu anticorp primar (1: 1000) peste noapte la 4 ° C cu agitare, spălată în PBS cu 0,05% Tween (PBS-T) și sondată cu anticorp secundar HRP conjugat (1: 10000 în PBS conținând 5% lapte praf) timp de 1 oră. După spălare, imunodetecția a fost efectuată folosind substratul chemiluminiscent cu durată extinsă (Pierce, Bonn, Germania) pe filme cu raze X (Kodak Biomax-ML, Sigma-Aldrich). Intensitățile benzilor au fost cuantificate densitometric folosind software-ul de imagine TINA 2.09 (DesignSoft Inc., Budapesta, Ungaria).
Înregistrări ale LTP în felii de hipocamp
Imagistica Ca 2+
Condiționarea fricii contextuale
Droguri pentru experimente comportamentale
Nifedipina (25 mg/kg) a fost suspendată în vehicul 10% Cremophor EL/PBS și diltiazemul (15 mg/kg) a fost suspendat în soluție salină (0,9% NaCI în apă). Injecțiile intraperitoneale au fost efectuate cu 50 min (nifedipină) sau 20 min (diltiazem) înainte de procesul de rechemare și protocolul de extincție efectuat în ziua 2 a testului contextual de condiționare a fricii.
Analize statistice
Comparațiile între două grupuri au fost efectuate cu testul t cu două cozi. Datele comportamentale au fost evaluate utilizând o analiză multifactorială a varianței (ANOVA) urmată de teste post-hoc Newman-Keuls, atunci când este cazul: ANOVA bidirecțional (cu „genotip” și „tratament” între factori de grup), genotip mixt bidirecțional ”ca între factorii de grup și „timp” ca în cadrul factorului de grup) și ANOVA mixtă cu trei căi (cu „genotip” și „tratament” ca între factorii de grup și „timp” ca în cadrul factorului de grup). Toate testele au fost cu două cozi, iar nivelul de semnificație a fost stabilit la p -/- Șoarecii sunt salvați prin activarea tranzitorie a L-VGCC în timpul inducției LTP