Expresia MBD2_v2 indusă de obezitate promovează tumorile care inițiază tulpina de cancer de sân triplu negativă

Instrumente

Urmăriți jurnalul

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Informatică, Wayne State University, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Corespondenţă

A. Bollig - Fischer, Barbara Ann Karmanos, Cancer Institute, 4100 John R. St. Detroit, MI, 48201, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Informatică, Wayne State University, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Corespondenţă

A. Bollig - Fischer, Barbara Ann Karmanos, Cancer Institute, 4100 John R. St. Detroit, MI, 48201, SUA

Abstract

Abrevieri

1. Introducere

În ultimii 25 de ani, prevalența obezității s-a dublat în 70 de țări, inclusiv în Statele Unite, iar aproape o treime din adulții din întreaga lume sunt acum supraponderali sau obezi (Afshin și colab., 2017). Creșterea pandemiei obezității este decisiv îngrijorătoare, deoarece obezitatea este un factor de risc cunoscut pentru o serie de boli cronice, debilitante sau care pun viața în pericol (OMS, 2000), cum ar fi artrita reumatoidă, diabetul zaharat de tip 2, bolile cardiovasculare și cancerul., 2000). Bazarea asocierii de risc între obezitate și aceste boli este acumularea de țesut adipos în exces care provoacă un răspuns imun înnăscut care provoacă inflamații cronice locale și sistemice, ale căror caracteristici includ niveluri crescute de citokine proinflamatorii, producând o producție crescută de radicali liberi, inclusiv reactivi specii de oxigen (ROS) (Crujeiras și colab., 2013; Гривенников și colab., 2010; Rocha și Libby, 2009; Wellen și Hotamisligil, 2005).

2. Materiale și metode

2.1 Testarea asocierilor dintre nivelurile de expresie a tumorii MBD2_v2 și rezultatele pacienților și indicele de masă corporală (IMC)

2.2 Liniile celulare, condițiile de cultură și testul de formare a mammosferei

Liniile celulare triple-negative ale cancerului de sân MDA - MB - 468 și MDA - MB - 231 au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA) și cultivate în mod obișnuit în 10% FBS Mediul Eagle modificat de Dulbecco, la 37 ° C, 5% CO2. Linia de celule SUM149 TNBC, dezvoltată și achiziționată de la Stephen Ethier (Forozan și colab., 1999), a fost cultivat în 5% FBS HAM F - 12 medii conținând 1 μg · mL -1 hidrocortizon și 5 μg · mL −1 insulină umană. Aceste trei linii celulare reprezintă subtipul molecular TNBC. Liniile celulare au fost autentificate prin scurtă analiză repetată în tandem utilizând sistemul PowerPlex (r) 16 de la Promega (Madison, WI, SUA). Prezența și capacitatea de auto-reînnoire a CSC-urilor au fost analizate în culturile de celule TNBC folosind testul de formare a mammosferei, așa cum a fost efectuat anterior (Bao și colab., 2017), și descris în Shaw și colab. (2012). Mamosferele formate au fost numărate și raportate ca o fracțiune din numărul total de celule însămânțate (1000). Imaginile au fost realizate cu ajutorul unui microscop Eclipse TE2000 - U (Nikon, Tokyo, Japonia). Testul intracelular MAK164 (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost utilizat pentru măsurarea nivelurilor de peroxid de hidrogen în celulele cultivate.

2.3 Analiza semicantitativă RT-PCR și imunoblot

2.4 Knockdown SRSF2 stabil și supraexprimare MBD2_v2 în liniile celulare

Lentivirusul - mediat, eliminarea shRNA a expresiei SRSF2 s-a făcut așa cum s-a descris anterior folosind sistemul de shRNAmir lentiviral OpenGiosystems Expression Arrest GIPZ (Bollig - Fischer și colab., 2011). Celulele MDA - MB - 468 au fost transduse cu vectori care vizează SRSF2 (nr. Cod RHS4430-98485060 și RHS4430-101104677) sau vectorul de control fără silențiere. Supraexprimarea stabilă a MBD2_v2 în celulele MDA - MB - 231 a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Bao și colab., 2017). Particulele lentivirale ambalate pentru supraexprimarea MBD2_v2 (NM015832.4) sau GFP au fost achiziționate de la Cyagen Biosciences (Santa Clara, CA, SUA).

2.5 Munca animalelor

2.6 Profilarea expresiei genomewide a tumorilor recoltate de la șoareci

2.7 Analiza statistică

Analiza statistică a fost efectuată folosind r 3.3.2 (http://www.R-project.org/). Graficele au fost generate cu r 3.3.2 sau prisma graphpad (Graphpad Software, San Diego, CA, SUA). valorile ≤ 0,05 sunt raportate ca semnificative. Al lui Welch t‐Testul a fost aplicat la datele semicantitative RT - PCR și la analiza mammosferei. Testul Gray al diferenței în incidența cumulativă a fost utilizat pentru a evalua semnificația diferențelor observate în frecvența formării tumorilor la șoarece și timpul până la eveniment între grupurile experimentale. Testul exact al lui Fisher a fost utilizat pentru a evalua diferența în frecvența formării tumorii la o dată dată. Cele mai mici pătrate generalizate, permițând observații corelate la același animal atunci când este cazul (adică, inoculare bilaterală), evaluarea interacțiunii dintre grup și timp a fost utilizată pentru a testa dacă ratele de creștere a tumorii au fost diferite între grupurile studiate. Greutatea corporală medie pentru șoareci a fost calculată pentru patru cuști în fiecare stare, până la 6 șoareci pe cușcă, măsurată de 2-3 ori pe săptămână timp de până la 185 de zile. A fost construit un model pătratic pentru a modela datele longitudinale. Diferențele dintre grupuri la un moment dat au fost comparate folosind predictorul liniar din model și cel al unui student tTest.