Excesul de greutate la șoareci și adipogeneza îmbunătățită in vitro sunt asociate cu lipsa ariciului

H.-J.L. și S.-B.J. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Abstract

Introducere

Prevalența obezității și a patologiilor metabolice asociate a atras atenția asupra identificării factorilor etiologici (1,2). Obezitatea apare din factori genetici, de mediu și comportamentali care influențează echilibrul energetic. Principala caracteristică a obezității este acumularea excesivă de țesut adipos alb (WAT) (1,3-5). Deși obezitatea este înțeleasă a fi o consecință reglementată la nivel central a supranutriției și/sau a cheltuielilor reduse de energie, procesele care reglementează expansiunea WAT la nivelul adipocitelor nu sunt bine caracterizate.

Expansiunea WAT are loc prin hipertrofia și hiperplazia adipocitelor, astfel încât astfel de procese implică probabil la un anumit nivel procesul adipogenezei (3,4). Adipogeneza a fost analizată cu linii celulare de preadipocite cum ar fi 3T3-L1 și diverse linii de șoarece mutante (6). Aceste studii au elucidat o rețea transcripțională centrată în jurul membrilor familiei PPARγ și C/EBP, care determină diferențierea preadipocitelor în adipocite care acumulează lipide (6). Studii recente au identificat celule din fracția vasculară stromală (SVF) din WAT care sunt celule progenitoare adipocite de bună-credință (7,8). Astfel de celule din WAT trebuie să răspundă la indicii hormonali și locali care reglementează întreținerea homeostatică a acestui țesut. Indiciile care acționează asupra celulelor progenitoare adipocitare nu sunt bine înțelese, dar printre cele implicate se află calea de semnalizare Hedgehog (HH).

Proteinele HH reglează evenimentele de dezvoltare în organisme la fel de diverse precum insectele și mamiferele. Dintre proteinele HH de la mamifere, Sonic Hedgehog (SHH) joacă rolul cel mai larg și este implicat în creșterea și/sau morfogeneza multor structuri corporale (9). Proteinele HH activează o cale de transducție a semnalului conservată (10-12). În absența ligandului, receptorul primar HH PTCH1 funcționează pentru a inhiba semnalizarea de către o a doua proteină de membrană, SMO. Legarea HH la PTCH1 ameliorează inhibarea semnalelor SMO și SMO pentru a activa genele țintă ale căii prin intermediul factorilor de transcripție GLI. Printre astfel de gene țintă se numără Gli1 și Ptch1 în sine și sunt adesea utilizate ca citiri ale activității căii (10-12).

CDO (numit și CDON), BOC și GAS1 sunt proteine de suprafață celulară care promovează activitatea căii HH ca coreceptori care leagă ligandul cu PTCH1 (13-20). CDO și BOC sunt proteine transmembranare înrudite (21,22), în timp ce GAS1 este o proteină ancorată GPI, fără legătură cu CDO și BOC (23). Analiza șoarecilor cu mutații vizate în Cdon, Boc și Gas1 a relevat că, deși niciuna nu este esențială pentru activitatea căii HH, acestea sunt necesare în mod colectiv pentru funcția căii în embrionul timpuriu al șoarecelui (13,14,16,19). Un complex ternar de ligand HH, PTCH1 și cel puțin unul dintre acești coreceptori pare a fi necesar pentru transducția cu succes a semnalului (15,16,24). Șoarecii Boc-Null, subiectul acestui studiu, sunt viabile și fertili, dar prezintă defecte în modelarea neuronală SHH-dependentă și ghidarea axonului (19,25-28).

Calea HH reglează negativ adipogeneza. Activarea căii HH fie cu SHH, fie cu purmorpamină agonistă SMO a inhibat adipogeneza 3T3-L1 și a liniilor celulare suplimentare (29-32). Mai mult, blocarea semnalizării HH, cu o formă dominantă-negativă a GLI2 sau a ciclopaminei antagoniste SMO, a sporit adipogeneza acestor celule ca răspuns la factorii inducători (31,32). Semnalele HH au blocat etapele timpurii ale adipogenezei, în amonte de expresia PPARγ (29,31,32). Aceste studii sugerează că calea HH funcționează pentru a bloca diferențierea preadipocitelor in vitro. Experimentele la șoareci sunt în concordanță cu această noțiune. Șoarecii adulți homozigoti pentru o alelă hipomorfă a Ptch1 au prezentat o masă WAT redusă, care avea niveluri mai scăzute de markeri adiposi și niveluri crescute de gene țintă HH (33). Țesutul adipos - mutația specifică a unui alt inhibitor al căii HH, Sufu, a dus la pierderea WAT (34). În cele din urmă, șoarecii cu obezitate indusă de dietă sau genetică (ob/ob) au prezentat o expresie scăzută a componentelor căii HH (31).

Deși șoarecii cu un câștig genetic de funcționare în activitatea căii HH au arătat pierderea WAT (33,34), nu s-a demonstrat că șoarecii cu o pierdere a activității HH au adipozitate sporită. Raportăm că șoarecii cu mutație a liniei germinale în Boc prezintă supraponderalitate dependentă de vârstă datorită creșterii WAT. Acești șoareci prezintă, de asemenea, un răspuns exagerat la o dietă bogată în grăsimi (HFD), iar fibroblastele embrioni Boc -/- se diferențiază în adipocite mai eficient decât celulele de tip sălbatic. Aceste rezultate arată că BOC, acționând probabil ca un coreceptor SHH, este necesar pentru menținerea greutății normale in vivo și reglarea adecvată a diferențierii adipogene in vitro.

Proiectare și metode de cercetare

Pentru evaluarea parametrilor metabolici (Fig. 2), șoarecii Boc +/+ și Boc -/- în vârstă de 5 luni au fost analizați cu cuști metabolice (Aparatul Harvard; Panlab). Măsurătorile au fost efectuate timp de 48 de ore, timp în care animalele au avut acces la alimente și apă. Temperatura corpului de bază a fost măsurată cu un echipament homeotermic HB-101/pătură (aparat Harvard).

Histologie, colorare roșie ulei O și colorare fosfatază alcalină placentară

Pentru colorarea hematoxilin-eozinei (H-E), WAT și țesuturile hepatice au fost fixate și prelucrate pentru secțiuni de parafină de 20 μm. Pentru colorarea cu ulei roșu O, ficatul a fost fixat în PFA 4% și deshidratat prin gradient de zaharoză urmat de o criozecție compusă a temperaturii optime de tăiere (10 μm) și colorare cu ulei roșu O. Pentru colorarea Oil Red O a fibroblastelor embrionare de șoarece diferențiate (MEF) și a celulelor 3T3-L1, culturile au fost fixate în 10% formaldehidă timp de 10 min și colorate cu Oil Red O. Plăcile colorate au fost tratate cu 1 mL izopropanol/4% NP-40 timp de 10 min printr-o agitare ușoară, iar roșul de ulei extras O a fost cuantificat prin măsurarea densității optice la 520 nm. Pentru colorarea fosfatazei alcaline placentare (PLAP), țesuturile au fost fixate cu 2% PFA plus 0,2% glutaraldehidă timp de 2 ore la 4 ° C, spălate în PBS, permeabilizate în 0,3% Triton peste noapte la 4 ° C, spălate în soluție salină, căldură inactivate pentru 30 min la 72 ° C, spălat în NTM (100 mmol/L NaCI, 100 mmol/L Tris-HCI, pH 9,5, 50 mmol/L MgCl2) tampon și colorat cu purpuriu BM (Roche).

Culturi celulare

Pregătirea SVF din WAT a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (8). Pe scurt, WAT a fost tocat cu foarfeca și digerat cu 2 mg/ml de colagenază I (Sigma-Aldrich) în DMEM la 37 ° C timp de 1 oră. S-a adăugat DMEM plus 10% FBS pentru a dubla volumul, adipocitele plutitoare au fost îndepărtate și digestul a fost filtrat printr-o plasă de 100 μm care a reținut vasele fracției de particule stromale. Filtratul a fost centrifugat la 800 g timp de 5 minute, iar peleta SVF a fost resuspendată în DMEM conținând 10% FBS și cultivată timp de 2 zile.

Izolarea MEF primare a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (35). Celulele 3T3-L1 și MEF au fost cultivate în mediu de creștere (DMEM plus 10% FBS) la subconfluență. Pentru diferențierea adipocitelor, celulele au fost crescute până la confluență și trecute în mediu de diferențiere I (mediu de creștere plus 0,5 μmol/L IBMX, 1 μg/μL insulină, 0,25 μmol/L dexametazonă, 2 μmol/L rosiglitazonă; Sigma-Aldrich) timp de 2 zile . Mediul de cultură a fost apoi schimbat în mediu de diferențiere II (mediu de creștere plus 2 μmol/L rosiglitazonă), iar mediul a fost schimbat la fiecare 2 zile. Pentru a activa semnalizarea SHH, MEF-urile au fost tratate cu 250 ng/mL SHH (sisteme R&D) sau 5,2 μmol/L purmorpamină (Calbiochem) în medii de diferențiere începând cu ziua de diferențiere 2 în continuare.