Evoluția congruentă a fitnessului și a robusteții genetice în virusul stomatitei veziculare
Isabel S. Novella
Departamentul de Microbiologie și Imunologie Medicală, Colegiul de Medicină, Universitatea din Toledo Campus de Științe ale Sănătății, Toledo, Ohio, SUA a
John B. Presloid
Departamentul de Microbiologie și Imunologie Medicală, Colegiul de Medicină, Universitatea din Toledo Campus de Științe ale Sănătății, Toledo, Ohio, SUA a
Cameron Beech
Departamentul de Microbiologie și Imunologie Medicală, Colegiul de Medicină, Universitatea din Toledo Campus de Științe ale Sănătății, Toledo, Ohio, SUA a
Claus O. Wilke
Center for Computational Biology and Bioinformatics, Section of Integrative Biology, and Institute for Cellular and Molecular Biology, Universitatea din Texas la Austin, Austin, Texas, SUA b
Date asociate
Abstract
INTRODUCERE
Replicarea predispusă la erori în virusurile ARN are ca rezultat dezvoltarea populațiilor de cvasispecii (1-4), nori de mutanți strâns înrudiți în echilibrul de selecție a mutațiilor (5-7). La populațiile de cvasispecii, robustețea genetică crescută poate oferi un avantaj selectiv (8-11), deoarece un număr mai mic de descendenți se pierd din cauza mutațiilor dăunătoare sau letale. Robustețea genetică aici este definită ca invarianță fenotipică în ciuda presiunii mutaționale (12). În ceea ce privește peisajele de fitness, selecția pentru rezistență favorizează acele populații care stau pe vârfuri de fitness largi în loc de vârfuri de fitness înguste. Studiile asupra organismelor digitale au arătat preferința pentru acest tip de vârfuri largi și au condus la expresia „supraviețuirea celor mai plate” (13). Multe dintre studiile care abordează relevanța robusteții genetice asupra evoluției moleculelor de ARN sunt analize computerizate și evoluție simulată (11, 14-17). Această abordare a condus la identificarea selecției pentru robustețe în genomii virusului hepatitei C (18) și microARN (19).
Înțelegerea solidității este de o relevanță deosebită pentru dezvoltarea medicamentelor antivirale și a vaccinurilor. Mutageneza letală (30) constă în creșterea ratelor de mutație pentru a produce populații cu atât de multe mutații încât informațiile genetice se pierd și virusul nu se poate reproduce (3, 6, 31). Această abordare ar avea o valoare limitată dacă virusul se poate adapta prin creșterea robusteții sale (32), dar simulările pe computer sugerează că robustețea genetică de la sine este puțin probabil să prevină dispariția prin mutageneză letală (33). În picornavirusuri pare să existe o corelație între robustețe și sensibilitate la mutageneza letală (34). Dezavantajul major al vaccinurilor vii atenuate este posibilitatea de reversie în timpul replicării la vaccinat. În termeni simpli, reversiunea este un caz de adaptare la gazda umană și, deoarece această adaptare depinde de disponibilitatea variației benefice, este ușor să ne imaginăm că o tulpină de vaccin mai robustă ar fi, de asemenea, o tulpină de vaccin mai sigură. Cu toate acestea, dacă limitele de robustete crescute sau favorizează evoluția este controversat (35-37).
Considerațiile teoretice și moleculare oferă o legătură între robustețea genetică și termostabilitate (38-40), iar lucrările asupra fagului phi-6 au arătat că clonele cu robustețe ridicată au dezvoltat o termostabilitate mai mare decât clonele cu robustețe scăzută (41). Lucrările asupra microARN-ului sunt controversate și, în timp ce rezultatele experimentale păreau să arate robustețe genetică și toleranță termică necorelate (19), există un dezacord cu privire la interpretarea datelor (42).
În prezentul raport, am folosit tulpini VSV nemutagenizate pentru a testa dacă selecția crescută sau relaxată a dus la modificări ale robusteții genetice și dacă există o corelație între robustețe și termostabilitate. Am analizat o colecție de tulpini pe care le-am generat prin pasaje placă-placă (43, 44) sau prin pasaje cu populație mare (29). Pasajele placă-placă minimizează selecția, în timp ce pasajele cu populație mare maximizează selecția. Rezultatele noastre au indicat că, așa cum s-a prezis, în absența selecției a existat o pierdere de robustețe, în timp ce în prezența selecției sa îmbunătățit robustețea. Am constatat, de asemenea, că robustețea nu este necesară pentru a acoperi cu termostabilitate în VSV; cu toate acestea, în absența selecției, arhitectura genetică VSV pare să impună o relație moderat puternică între robustețe și termostabilitate. În cele din urmă, în mod neașteptat, termostabilitatea a crescut în timpul pasajelor placă-placă, chiar dacă robustetea a scăzut.
MATERIALE ȘI METODE
Celule și viruși.
Determinări de fitness.
Starea de fitness a fost măsurată în competiție directă, așa cum s-a descris anterior (45, 49). Pentru tulpinile derivate din greutate, am utilizat MARM U ca referință, iar pentru tulpinile derivate din MART am folosit greutatea ca referință. În rezumat, cei doi concurenți au fost amestecați și amestecurile utilizate pentru a determina raporturile relative folosind teste de placă în prezența și absența I1 MAb și, de asemenea, pentru a efectua un pasaj de competiție cu 2 × 105 PFU. După 20 până la 24 de ore, titrurile de virus au atins aproximativ 10 10 PFU/ml, iar descendenții din competiție au fost folosiți pentru cuantificarea rapoartelor și pentru a efectua un al doilea pasaj de competiție în aceleași condiții. După mai multe pasaje, modificările jurnalului în raport au fost reprezentate în raport cu timpul, iar antilogaritmul pantei potrivirii a fost valoarea de fitness.
Măsurători de rezistență.
Am folosit rezistența la mutageneză ca surogat al robusteții. Am însămânțat baloane T-25 cu celule BHK-21 și, după creștere peste noapte, am tratat monostratele semiconfluente rezultate cu 5 ml soluție de 5-fluorouracil (FU) dizolvată în MEM plus FBS la o concentrație finală de 0 (martor), 10, 35 sau 100 μg/ml. După 6,5 ore de incubație la 37 ° C, timp în care concentrația medicamentului în interiorul celulelor echilibrează, monostratele au fost infectate cu aproximativ 105 PFU, iar infecțiile au fost monitorizate pentru efectul citopatic (CPE), care s-a dezvoltat mai lent cu concentrații crescute de mutagen, deci în absența mutagenului a fost complet la 24 h postinfecție, în prezența a 10 μg/ml a durat 48 h, iar în prezența a 35 sau 100 μg/ml a durat 72 h. Toate tulpinile au fost recuperate în același timp în prezența unei cantități date de medicament. Când CPE a fost completă, am recuperat randamentele virale și am determinat titrurile prin testul duplicat al plăcii. Am normalizat apoi titrurile împărțindu-le la titrul de control.
Pentru a cuantifica robustețea, am regresat titlurile normalizate, transformate în log, față de concentrațiile de FU transformate în rădăcină pătrată. Datele au fost aproape liniare după această transformare pentru toți mutanții (vezi cifrele din materialul suplimentar). Linia de regresie a fost potrivită fără o interceptare, deoarece titrul normalizat transformat în jurnal trebuie să fie zero prin definiție. Am folosit panta liniei ca măsură a robusteții noastre. Toate valorile pantei sunt negative și o pantă mai negativă indică o sensibilitate mai mare la FU și, prin urmare, o rezistență mai mică.
Determinări ale frecvenței mutante.
Pentru wt și populații derivate, am determinat frecvența mutanților rezistenți la I1. Probele din stocurile înghețate au fost diluate după cum este necesar și titrate în teste de placă triplicate fără I1 pentru a calcula concentrația totală de virus. În paralel, am folosit probe mai concentrate (de obicei cu 3 până la 4 ordine de mărime mai concentrate) pentru a efectua teste de placă în prezența concentrațiilor în exces de I1 în suprapunerea de agaroză. Foarte important, nu am tratat virusul cu anticorpi înainte de placare, deoarece acest tratament ar duce la subestimarea semnificativă a frecvențelor mutante datorită amestecării și ascunderii fenotipice (50, 51). Numerele de plăci în aceste condiții ar reprezenta numărul de mutanți MARM din stoc. Pentru a calcula frecvența mutantului, am determinat mediile MARM împărțite la mediile în greutate.