Evaluarea ecologiei microbiene a metanogenilor ruminali la bovine cu furaje diferite
ABSTRACT
Construirea de biblioteci de ARNr 16S. ADN-ul total individual extras din fluidul galben a fost diluat la o concentrație de 50 ng μl -1 și a fost combinat prin amestecarea a 2 μl din fiecare probă de ADN de la animale eficiente (n = 29) (biblioteca 1) și animale ineficiente (n = 29) bibliotecă 2) pentru construcția bibliotecii. Gena ARNr parțială 16S (~ 800 bp) a fost amplificată cu perechea de primer universal Met 86f/Met 915r (Tabelul 1), utilizând următorul program: o denaturare inițială timp de 5 minute la 94 ° C; 30 de cicluri la 94 ° C timp de 30 s, 57 ° C timp de 30 s și 68 ° C timp de 1 min; și o alungire finală timp de 7 minute la 68 ° C. Soluția de PCR (50 μl) conținea 1 μl de 20 pmol din fiecare primer, 1 μl de 10 mM deoxinucleozid trifosfat, 2,5 U de Taq polimerază (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 × tampon PCR, 1 μl de 50 mM MgCl2, și 1 μl de șablon de ADN colectat. Produsele PCR amplificate au fost apoi clonate în vectorul TOP10 (trusa de clonare TOPO TA; Invitrogen) prin utilizarea transformării chimice. Coloniile cu inserție au fost apoi selectate pe mediu S-Gal (Sigma, St. Louis, MO), iar ADN-ul plasmidic a fost extras folosind un kit de extracție a plasmidei Millipore (Millipore, Billerica, MA).
Grundurile utilizate în acest studiu pentru a viza genele metanogenului 16S rARN
Secvențierea și analiza filogenetică. Din bibliotecile 1 și 2, respectiv 624 și 672 de clone au fost selectate aleatoriu și supuse analizei secvenței cu un sistem de secvențiere ABI 3730, folosind un kit de secvențiere a ciclului ABI PRISM BigDye Terminator versiunea 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) Reacția de secvență a fost efectuată cu 10 μl de soluție conținând 0,5 μl BigDye, 3,2 pmol de M13 Forward (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) sau primer M13 Reverse (TTCACACAGGAAACAGCTATGAC), 2,0 μl de tampon de secvențiere 5 × și 20 ng de ADN plasmidic ca șablon. Toate secvențele au fost supuse căutărilor BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pentru a determina cel mai apropiat taxon cunoscut și au fost aliniate utilizând programul ClustalW (http://www.ebi.ac. uk/Tools/clustalw2 /). Analiza filogenetică a fost efectuată utilizând metoda de îmbinare vecină cu pachetul PHYLIP (versiunea 3.67) (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Numerele de bootstrap obținute de la 1.000 de replici au fost alocate lângă noduri pentru a verifica gruparea secvențelor.
Analiza clonării bibliotecii. Bibliotecile obținute au fost apoi analizate folosind programul Mothur (Mothur v1.3.0, http://www.mothur.org/wiki/Main_Page) prin compararea unităților taxonomice operaționale (OTU) pe baza 97% similitudine între secvențe. Matricile de distanță au fost calculate utilizând programul DNADIST din pachetul software PHYLIP. Analiza de rarefacție a structurii bibliotecii a fost realizată pe baza principiului din programul DOTUR (28). Indicii diversității, cum ar fi indicele Shannon, indicele Simpson și indicele Chao1, au fost folosiți pentru a măsura diversitatea fiecărei biblioteci. Diferențele dintre biblioteci au fost analizate prin compararea nivelurilor de acoperire a eșantioanelor, a similitudinilor apartenenței la comunitate (indicele Ochiai) și a structurilor comunității (indicele Bray-Curtis) pe baza principiului din programul ∫-LIBSHUFF (27). Diversitatea comunității a fost comparată într-un context filogenetic, utilizând testul de semnificație UniFrac și testul P în cadrul UniFrac (18).
Grundurile utilizate în acest studiu pentru analiza qRT-PCR
Analize statistice. Numerele copiilor și proporțiile speciilor specifice de metanogen au fost obținute de la fiecare individ, iar valoarea medie a fost utilizată pentru analiza statistică. Testul t al studentului a fost utilizat pentru a verifica diferența în fiecare specie vizată de metanogen între animalele L-RFI și H-RFI. Un model mixt de covarianță simplă a fost utilizat pentru a corela populația de metanogen cu producția de acizi grași volatili și RFI utilizând sistemul SAS (versiunea 9.1; Institutul SAS, Cary, NC). Semnificația a fost definită la valorile P ale numerelor de acces la secvența nucleotidică. Secvențele de nucleotide generate din această lucrare au fost depuse în GenBank sub numerele de acces FJ579097 la FJ580045.
REZULTATE
Comparație de secvențe generate din biblioteci de clone 16S. Pentru a identifica profilurile de metanogen din rumen, s-au folosit diferite combinații de primeri metanogeni universali raportați pentru a amplifica produsele genei ARNr 16S complete sau parțiale pentru construcția bibliotecii. Dar încercarea de a genera un fragment complet de ARNr 16S cu combinația de 21F (29) și 1389-1406R (17) așa cum este descris de Ohene-Adjei și colab. (25) nu a avut succes, deși acești primeri au vizat cu succes metanogenii totali din rumenul ovin. Utilizările Met 86f/Met 1340r, așa cum sunt subliniate de Wright și Pimm (39) și combinația exemplară 21F/Met 1340r, nu au putut genera produse PCR de la toate animalele. Doar perechea de exemple Met 86f/Met 915r care vizează un produs parțial al genei ARNr 16S (~ 800 bp) a generat ampliconi din toate cele 58 de probe galbene. Prin urmare, această pereche de exemple a fost utilizată pentru a amplifica ADN-ul galben grupat pentru construirea bibliotecii.
În total, 482 și 490 secvențe au fost obținute din biblioteca 1 (animale L-RFI reunite) și biblioteca 2 (animale H-RFI grupate), respectiv. Din romenurile animalelor L-RFI (biblioteca 1), 478 din 482 secvențe au fost identificate ca fiind metanogene, în timp ce 471 din 490 secvențe au fost identificate ca fiind metanogene din romenurile animalelor H-RFI (biblioteca 2). Secvențele identificate ca fiind nemetanogene, 4 secvențe din biblioteca 1 și 19 secvențe din biblioteca 2, s-au dovedit a aparține a 13 filotipuri bacteriene. Deoarece până la 16 pb din secvențele de exemplu se potrivesc cu aceeași regiune a bacteriilor, nu este surprinzător faptul că primerii metanogeni universali ar putea amplifica și unele grupuri de bacterii. Aceste secvențe nu au fost incluse pentru analiza metanogenă a comunității.