Etichetarea cu o singură moleculă pentru studierea traficului de transportatori renali American Journal of

Divizia de Hipertensiune și Cercetare Vasculară, Departamentul de Medicină Internă, Spitalul Henry Ford, Detroit, Michigan

Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Medicină a Universității de Stat Wayne, Detroit, Michigan

Adresa pentru cereri de retipărire și alte corespondențe: A. B. Jaykumar, 6001 Forest Park Rd., ND7.202, Dallas, TX 75235 (e-mail: [e-mail protejat]).

Divizia de Hipertensiune și Cercetare Vasculară, Departamentul de Medicină Internă, Spitalul Henry Ford, Detroit, Michigan

Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Medicină a Universității de Stat Wayne, Detroit, Michigan

Abstract

Abilitatea de a detecta și urmări molecule unice prezintă avantajul vizualizării comportamentului complex al proteinelor transmembranare cu o rezoluție de timp și spațiu care altfel s-ar pierde cu tehnicile de marcare tradiționale și biochimice. Dezvoltarea de noi sonde de imagistică a oferit o metodă robustă pentru a studia traficul și dinamica suprafeței acestora. Această mini-revizuire se concentrează pe tehnologia actuală disponibilă pentru marcarea unei singure molecule a proteinelor transmembranare, avantajele și limitările acestora. De asemenea, discutăm aplicarea acestor tehnici la studiul traficului de transport renal în lumina cercetărilor recente.

Dezvoltarea proteinelor fluorescente verzi și a altor proteine fluorescente verzi (FP) roșii/galbene/îmbunătățite, împreună cu versiunile sensibile la pH ale etichetelor (3), au oferit progresul inițial în capacitatea de a eticheta proteinele transmembranare, cum ar fi sodiul renal - cotransportor bicarbonat, cotransportor renal de sodiu-fosfat-2a), transportor renal de glucoză-4 (sau GLUT4), printre altele (2, 6, 18, 26, 36, 46, 50, 90, 91, 95, 96) 1A). Modificările ulterioare ale secvenței de codare FP și-au îmbunătățit proprietățile spectrale și biochimice. Proprietățile fluoroforului, cum ar fi coeficientul de extincție, randamentul cuantic, fotostabilitatea și sensibilitatea pH-ului (72) trebuie luate în considerare pentru diferite aplicații imagistice, cum ar fi transferul de energie prin rezonanță fluorescentă (24), microscopie confocală (79), microscopie fluorescentă cu reflexie internă totală (51) sau super -microscopie de rezolvare (62, 78). Cu toate acestea, există dezavantaje majore ale utilizării FP pentru etichetarea proteinelor de membrană, cum ar fi interferența cu activitatea endogenă a proteinei marcate din cauza supraexprimării (1), oligomerizarea cauzată de FP (68) și dimensiunea mare a etichetei.

30 kDa) (100). Aceste dificultăți au fost ocolite într-o oarecare măsură de strategii care reduc supraexpresia (4), optimizarea designului și lungimii linkerului și alegerea locului pentru inserarea secvenței FP (5, 48, 100). În ciuda contribuției inițiale enorme a FP standard în a face posibilă microscopia cu rezoluție superioară, proprietatea lor de a suferi o albire fotovoltaică ireversibilă, o fotostabilitate scăzută și un randament cuantic limitează utilizarea lor pentru experimentele la scară lungă. Cu toate acestea, proteinele fluorescente nou proiectate, cum ar fi proteinele fluorescente în infraroșu apropiat pe bază de fitocrom, au un raport semnal/zgomot și fotostabilitate mult mai ridicate, permițând astfel imagini mai profunde în țesuturi, ceea ce este, prin urmare, relevant pentru animalele vii sau excizate - modele de țesut (33).

FIG. 1.Reprezentarea diagramă a metodelor de etichetare cu o singură moleculă discutate în revizuire. Dreptunghiul în gri reprezintă o proteină transmembranară, liniile duble reprezintă bistratul fosfolipidic, iar o linie galbenă reprezintă o entitate fluorescentă. ACP, proteină purtătoare de acil; BAD, domeniul acceptor de biotină; BC2, epitop liniar scurt corespunzător 16-27 reziduuri de β-catenină; eGFP, proteină fluorescentă verde îmbunătățită; FAP, peptidă activatoare de fluorogen; GFP, proteină fluorescentă verde; GST-O1, glutation-s-transferază omega1; HA, hemaglutinină; LAP, peptida acceptorului acidului lipoic; PCP, proteină purtătoare de peptidil; RFP, proteină fluorescentă roșie; SBP, peptidă de legare a streptavidinei; TC, tetracysteine; UAA, aminoacid nenatural; YFP, proteină fluorescentă galbenă; α-BTX, α-bungarotoxină. Alte nume de etichete utilizate în exemple sunt nume de mărci comerciale, cum ar fi eticheta Halo, eticheta CLIP, eticheta SNAP și eticheta FLAG.