Eficacitatea terapeutică a tutunului transgenic cu conținut scăzut de alcaloizi administrat oral care exprimă om
Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agro - Food Canada, 1391 Sandford St., London, ON, Canada, N5V 4T3
Lawson Health Research Institute, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Institutul de cercetare Robarts, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Lawson Health Research Institute, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Plantigen Inc., 700 Collip Circle, Londra, ON, Canada, N6G 4X8
Sunnybrook and Women's College Health Science Center, 2075 Bayview Avenue, Room A338, Toronto, ON, Canada, M4N 3M5
Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agro - Food Canada, 1391 Sandford St., London, ON, Canada, N5V 4T3
Lawson Health Research Institute, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Institutul de cercetare Robarts, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agro - Food Canada, 1391 Sandford St., London, ON, Canada, N5V 4T3
Lawson Health Research Institute, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Institutul de cercetare Robarts, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Lawson Health Research Institute, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Plantigen Inc., 700 Collip Circle, Londra, ON, Canada, N6G 4X8
Sunnybrook and Women's College Health Science Center, 2075 Bayview Avenue, Room A338, Toronto, ON, Canada, M4N 3M5
Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agro - Food Canada, 1391 Sandford St., London, ON, Canada, N5V 4T3
Lawson Health Research Institute, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
Institutul de cercetare Robarts, Londra, ON, Canada, N6A 5A5
rezumat
Introducere
Descris inițial în 1989 (Fiorentino și colab., 1989), IL-10 s-a arătat în numeroase studii că este o citokină antiinflamatoare puternică prin capacitatea sa de a inhiba activarea celulelor T macrofage și T-helper-1 (Th1), precum și expresia TNF-α ( Vieira și colab., 1991; Kuhn și colab., 1993; Schreiber și colab., 1995). Deși administrarea sistemică a IL-10 a arătat un beneficiu clar în CD și UC rezistente la steroizi, din păcate, în studiile pe termen lung, beneficiul clinic și îmbunătățirea endoscopică a inflamației intestinale la pacienții cu DC activă moderată și cronică activă au fost compensate de efectele dăunătoare asupra niveluri de celule roșii din sânge și trombocite, care au fost probabil legate de administrarea sistemică (subcutanată) de doze mai mari de IL-10 (> 10 µg/kg) (Schreiber și colab., 2000). Pentru a evita toxicitatea asociată cu administrarea sistemică, Steidler și colab. (2000) au utilizat administrarea intragastrică de Lactococcus lactis secretând IL-10 pentru a reduce inflamația la modelele murine de colită ale IL-10 -/- și dextran sulfat de sodiu (DSS). În studiile ulterioare, o tulpină dependentă de timidină Lactococ a fost utilizat pentru a aborda problemele de biosecuritate și potențialei evadări de mediu ale organismelor modificate (Steidler și colab., 2003).
rezultate si discutii
IL-10 exprimat de plante nu este glicozilat
Interleukina-10 umană recombinantă din plante (pIL-10) nu este glicozilată. IL-10 recombinant (rIL-10), pIL-10 și eritropoietină recombinantă (rEPO) au fost tratați în tampon de deglicozilare timp de 2 ore la 37 ° C cu sau fără PNGază F. Banda 1, rIL-10; banda 2, rIL - 10 cu PNGase F; Articolul 3, pIL-10; banda 4, pIL - 10 cu PNGase F; banda 5, rEPO; banda 6, rEPO cu PNGase F.
IL-10 exprimat de plante este rezistent la digestia lichidului gastric și intestinal
Proteina IL-10 purificată este acid-labilă și este degradată rapid în condiții de pH scăzut (Syto și colab., 1998). Întrucât intenția noastră era de a furniza rIL-10 exprimat în țesutul plantei ca supliment alimentar, a fost esențial să determinăm dacă pIL-10 este rezistent la degradarea gastro-intestinală și dacă matricea celulară a plantei a contribuit la orice protecție împotriva enzimelor și condiții de pH. In vitro studiile cu soluții digestive simulate sunt utilizate pe scară largă ca modele de digestie a animalelor pentru a investiga eliberarea controlată a produselor farmaceutice experimentale (Doherty și colab., 1991), precum și digestibilitatea proteinelor vegetale și animale și a aditivilor alimentari (Zikakis și colab., 1977; Tilch și Elias, 1984). Prin urmare, am comparat stabilitatea hIL-10 produsă în plantele transgenice, fie încorporate în țesutul de tutun liofilizat, fie purificate din țesutul plantei, folosind fluid gastric simulat (SGF, 3,2 g/L pepsină, pH 1,2) pentru a modela condițiile stomacului și lichid intestinal simulat (SIF, 10 g/L pancreatină, pH 6,8) pentru afecțiuni proximale ale intestinului subțire. Toate experimentele de digestie au fost efectuate cu proteine dimerice native rIL-10 și pIL-10 care s-au dovedit anterior a fi biologic active (Menassa și colab., 2001).
În absența materialului vegetal, interleukina-10 umană recombinantă din plante purificată (pIL-10) a fost comparată cu IL-10 recombinantă (rIL-10). IL-10 a fost detectat prin imunoblotare după digestia rIL-10 (a, c) și a pIL-10 (b, d) în fluidul gastric simulat (SGF) la pH acid (a, b) și neutru (c, d). Stelele umplute indică monomerul IL-10; stelele deschise indică dimerul IL-10. pIL-10 este puțin mai mare decât rIL-10 datorită etichetei terminale C (Menassa și colab., 2001).
Detectarea interleukinei-10 (IL-10) prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA). (a) Tratamentul frunzelor liofilizate în fluid gastric simulat (SGF) la pH neutru sau acid. (b) Tratamentul IL-10 recombinant purificat (rIL-10), IL-10 uman recombinant de plante (pIL-10) sau frunze liofilizate care exprimă IL-10 în lichid intestinal simulat (SIF).
Administrarea orală cronică a tutunului cu conținut scăzut de nicotină este bine tolerată de șoareci
S-a demonstrat că nicotina afectează inflamația atât la pacienții cu UC, cât și la cei cu CD (Birrenbach și Bocker, 2004). Deși nicotina are un impact negativ asupra jejunitei, pare să îmbunătățească colita la șoarecii IL-10 -/-, sugerând că există efecte directe ale nicotinei asupra sistemului imunitar (Eliakim și colab., 2001). Prin urmare, era important să ne asigurăm că efectele chiar și unor cantități mici de nicotină din tutunul cu alcaloizi slabi nu confundau observațiile la șoarecii hrăniți cu țesut de tutun. Tutun cu conținut scăzut de alcaloizi, cultivat în camere cu mediu controlat, conține între 1,5 și 3,1 µg nicotină/g greutate uscată (DW) (Tabelul 1). Expunerea maximă calculată mai mică de 6 µg pe zi a fost cu mult sub nivelurile de expunere de 75 µg pe zi, care au avut efect la șoarecii IL - 10 -/- (Eliakim și colab., 2002). În concordanță cu aceasta, nu a existat nicio diferență în niciun parametru clinic, creștere în greutate sau histologie intestinală la șoareci cărora li s-a administrat țesut din plante de tutun cu conținut scăzut de nicotină față de cei care au primit chow normal (nu este prezentat).
| Procesul 1 | C57BL/6 | 8 | 20 | 2.9 | 5.2 | 2,68 |
| Procesul 2 | C3H | 8 | 20 | 3.1 | 2 | 4.5 |
| Procesul 3 | C3H | 5 (control), 10 (grup IL - 10) | 30 | 1.5 | 1.4 | 6 |
- * Variabilitatea conținutului de nicotină și IL-10 este rezultatul diferențelor în condițiile de creștere ale diferitelor loturi, adică camere de creștere diferite, vârsta diferită a plantelor la recoltare.