Efectul sării asupra hipertensiunii și a stresului oxidativ la un model de șobolan obezitate indusă de dietă americană

Departamentul de Științe Fiziologice, Școala de Medicină din Virginia de Est, Norfolk, Virginia 23507

Abstract

Animale

Toate procedurile care implică animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Eastern Virginia Medical School. Optsprezece șobolani masculi SD (300-350 g) cușcați individual au fost selectați aleatoriu pentru a fi hrăniți cu o dietă moderat bogată în grăsimi (MHF) cu sodiu 0,8% (32% kcal ca grăsime, Research Diets, New Brunswick, NJ), în timp ce șase șobolani (martorii) au fost hrăniți cu dietă purificată cu conținut scăzut de grăsimi (LF) cu sodiu 0,8% (10,6% kcal ca grăsime, Research Diets) timp de 10 săptămâni. Un număr identic de șobolani a fost plasat pe dietele MHF și LF, fiecare conținând fie 2 sau 4% sodiu (diete bogate în sare). Hrana și apa au fost furnizate ad libitum pe tot parcursul experimentului. Greutățile corporale (BW) și lungimile au fost măsurate inițial și apoi săptămânal împreună cu aportul de alimente. Șobolanii hrăniți cu dieta MHF atât cu sare scăzută, cât și cu conținut ridicat de sare s-au divizat în grupuri distincte pe baza câștigurilor BW. Atribuirea șobolanilor în obezitate (OP) ( = 8) și rezistent la obezitate (OR) = 8) grupurile au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (12).

TA sistolică

Debutul și dezvoltarea hipertensiunii arteriale au fost evaluate prin utilizarea metodei manșetei cozii cu un Narco Biosystems Electro-Sphygnomanometer (Houston, TX). TA a fost măsurată în condiții conștiente la începutul experimentului și la 1, 5, 8 și 10 săptămâni de dietă. Pentru fiecare măsurare s-a înregistrat media a cinci citiri de presiune.

Evaluarea stresului oxidativ

Producția de anion superoxid a fost măsurată în inele aortice izolate folosind o metodă descrisă anterior (12, 21). Pe scurt, inelele aortice de 5 mm au fost preincubate în tampon Krebs-bicarbonat, la 37 ° C, timp de 30 de minute și apoi transferate într-un cocktail conținând 5 μmol/l de lucigenină și măsurate imediat, la fiecare 2 minute, timp de 15 minute în total, folosind un contor scintilație setat în modul în afara coincidenței. Citirile au fost reprezentate grafic și zona de sub curbă a fost integrată. Rezultatele au fost normalizate pe miligram de ADN măsurat folosind colorantul Hoechst 33258 așa cum este descris (27). Specificitatea reacției a fost testată prin capacitatea a 50 U/ml de SOD de a stinge chemiluminescența la sfârșitul măsurării.

Gratuit 8-izoprostan F2α. Isoprostanii au fost măsurați prin EIA utilizând un kit de la Cayman Chemicals așa cum s-a descris anterior (12). Urina colectată în cuști metabolice pe o perioadă de 24 de ore a fost suplimentată cu 0,05% butilat hidroxitoluen și înțepată cu 8- [3H] izoprostan. Probele (1 ml) au fost trecute pe o coloană de afinitate (Cayman Chemicals) și numai izoprostanii liberi au fost eluați folosind 95% metanol. Eluatul a fost evaporat la sec sub un curent de N2 și peleta a fost resuspendată într-un tampon de testare de 1 ml. Fiecare probă a fost testată în duplicat la două diluții diferite și corectată pentru recuperarea individuală a 8- [3H] izoprostanului, iar rezultatele au fost mediate. Nitratul/nitritul a fost testat atât în plasmă, cât și în urină (diluat 1:50 în PBS) utilizând o metodă colorimetrică LDH cu un kit de la Cayman Chemicals.

Imunohistochimie pentru 4-hidroxi-2-nonenal. Rinichii au fost fixați în 10% formalină tamponată timp de 3 ore și parafină încorporată. Secțiunile au fost incubate cu un anticorp policlonal recunoscând 1: 1 aducti Cys, His, Lys-4 hidroxi-2-nonenali „Michael” (Calbiochem, diluție 1: 750). Diapozitivele au fost apoi reacționate cu anticorp anti-iepure biotinilat de capră (diluție 1: 500; Vector Laboratories, Burlin-game, CA), cu reactivul ABC-Elite avidin (Vector Laboratories) și, în cele din urmă, cu Immuno Pure Metal Enhanced DAB Set de substrat (Pierce, Rockford, IL).

Hipertrofie vasculară și scleroză renală

Zona peretelui aortic. Secțiunile subțiri ale țesutului încorporat în parafină au fost colorate timp de 1 min cu albastru de toluidină și analizate așa cum s-a descris anterior (10).

Histologie renală. Rinichii au fost fixați în 10% formalină tamponată timp de 4 ore și încorporate în parafină. Secțiunile au fost colorate folosind reactivul periodic acid-Schiff (PAS) și contracolorate cu hematoxilină. Pentru a evalua gradul de scleroză segmentară, trei anchetatori independenți au examinat diapozitivele într-o manieră oarbă, amestecând diapozitivele după acoperirea numerelor de protocol. În fiecare caz, 80-100 glomeruli au fost examinați pentru fiecare lamă și clasificați individual pe o scară de la 0 la 2+ în funcție de gradul de scleroză glomerulară. Gradul 0 era un glomerul cu aspect normal; gradul 1+ s-a caracterizat printr-o expansiune ușoară a matricei mezangiale, fără ocluzie în capilarele glomerulare sau aderență la capsula Bowman; și gradul 2+ a inclus extinderea matricei mezangiale, de obicei focală cu aderență la capsula Bowman și un anumit grad de ocluzie capilară. S-a obținut un scor reprezentând suma notelor pentru fiecare șobolan.