Efectele dietei și ale fundalului genetic asupra proteinei de legare a elementelor de reglementare a sterolului-1c,

Abstract

FPLC, cromatografie lichidă cu performanță rapidă
HFD, dietă bogată în grăsimi
LFD, dieta saraca in grasimi
MUFA, acid gras monoinsaturat
PGC, receptor activat de proliferator peroxizom-γ coactivator
SCD, stearoil-CoA desaturază
SOCS, supresor al semnalizării citokinelor
SREBP, o proteină de legare a elementelor de reglare a sterolului

Sindromul metabolic este o constelație de constatări, incluzând obezitatea centrală, rezistența la insulină, dislipidemia, hipertensiunea și steatoza hepatică, care predispune la diabet, boli cardiovasculare și cancer. Deoarece prevalența diabetului, a obezității și a sindromului metabolic ating proporții uluitoare, multă atenție s-a concentrat asupra etiologiilor lor și a relației dintre aceștia (1,2). Deși atât factorii genetici, cât și cei de mediu joacă în mod clar un rol, exact modul în care acești factori interacționează pentru a produce sindromul metabolic și diferitele sale componente rămâne neclar.

La majoritatea oamenilor, rezistența la insulină pare a fi poligenică și eterogenă (3). Astfel, există mai multe gene care pot contribui la fenotip, iar dezvoltarea bolii la orice individ poate implica doar un subgrup specific al acestor gene care variază de la populație la populație. Se crede că populațiile cu risc ridicat predispuse la dezvoltarea obezității și a rezistenței la insulină, precum indienii Pima și mexicanii americani, sunt îmbogățite pentru grupuri de gene care acționează împreună pentru a produce sindromul metabolic în contextul unui factor de declanșare adecvat de mediu, cum ar fi dietă occidentală bogată în grăsimi.

Dereglarea metabolismului lipidic hepatic poate juca un rol central în patogeneza sindromului metabolic. McGarry (7) a propus că sinteza crescută a lipidelor de către ficat produce rezistență la insulină în alte țesuturi, cum ar fi mușchii. Depozitarea crescută a lipidelor în ficat are ca rezultat modificări ale grăsimilor, care sunt acum cunoscute a fi o caracteristică a sindromului metabolic (8). Aceste modificări formează un spectru de patologie, denumită boală hepatică grasă nealcoolică, variind de la steatoza benignă simplă la steatohepatita nealcoolică, care poate evolua până la ciroză și insuficiență hepatică (9). Se crede că boala hepatică grasă nealcoolică poate fi acum cea mai frecventă cauză a cirozei criptogene în această țară (10). Pacienții cu sindrom metabolic au, de obicei, trigliceride crescute și HDL scăzut (11). Dislipidemia este strâns legată de morbiditățile cardiovasculare asociate sindromului metabolic și poate fi atribuită, cel puțin parțial, manipulării aberante a lipidelor de către ficat (12).

Pentru a înțelege modul în care genele interacționează cu grăsimile din dietă pentru a produce modificările metabolismului lipidic care apar în sindromul metabolic, am folosit două tulpini de șoareci, reprezentând diferențe de susceptibilitate la dezvoltarea rezistenței la insulină. Șoarecii C57Bl/6 (B6) s-au dovedit anterior să dezvolte diabet atunci când sunt supuși rezistenței la insulină indusă genetic datorită unei deleții duble heterozigote a unei alele a receptorului de insulină și a unei alele substrat-1 a receptorului de insulină (13,14). Șoarecii 129Sv (129), pe de altă parte, sunt protejați de diabet atunci când poartă același defect heterozigot al receptorului de insulină/al receptorului de insulină substrat-1. În studiul de față, șoarecii B6 și 129 au fost plasați pe două extreme ale dietei: o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD; 14% calorii din grăsimi) și o dietă bogată în grăsimi (HFD; 55% calorii din grăsimi). Am comparat efectele factorilor genetici și dietetici nu numai asupra glucozei, ci și asupra profilurilor lipidice serice și hepatice și a expresiei genice lipogene hepatice, pentru a înțelege mai bine cum acești factori modifică metabolismul lipidic și pentru a identifica elementele cheie care controlează progresia sindromului metabolic.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Șoarecii masculi C57Bl/B6 și 129S6/SvEvTac (Taconic) de șase săptămâni au fost plasați pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi cu conținut ridicat de carbohidrați (NIH # 31; Taconic) sau cu o dietă bogată în grăsimi cu conținut scăzut de carbohidrați (TD93075; Harlan Teklad). LFD obține 14% calorii din grăsimi, 25% calorii din proteine și 61% calorii din carbohidrați și s-a constatat că conține 1,5% acizi grași saturați, 2,7% acizi grași mononesaturați (MUFA) și 0,6% acizi grași polinesaturați în greutate. HFD obține 55% calorii din grăsimi, 21% calorii proteine și 24% calorii din carbohidrați și s-a constatat că conține 4,2% acizi grași saturați, 5,0% MUFA și 11,2% acizi grași polinesaturați. LFD și HFD au 15,4 și respectiv 7,1 mg de colesterol la 100 g, respectiv. Acidul arahidonic a fost nedetectabil în ambele diete. Șoarecii au fost menținuți pe un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore; cu excepția cazului în care se indică altfel, au fost prelevate probe de ser, iar șoarecii au fost uciși între orele 9:00 și 11:00 a.m., în stare nedeterminată la vârsta de ∼6 luni. Nivelurile de insulină au fost măsurate în probe de plasmă de șoareci hrăniți aleatoriu utilizând kitul ELISA Crystal Chem și standardele de insulină de șoarece. Trei cohorte independente au fost utilizate pentru efectuarea acestor experimente.

Analiza lipidelor serice.

Au fost reunite volume egale de ser de la trei la patru șoareci la post de 6 ore (începând dimineața). Colesterolul și trigliceridele au fost măsurate folosind kiturile Sigma 352 și 339, adaptate pentru plăcile de microtitrare. În plus, serul a fost supus cromatografiei lichide cu performanță rapidă (FPLC) așa cum s-a descris anterior (15) și colesterolul a fost măsurat în fracțiile eluate. Analiza lipidelor serice a fost realizată de nucleul lipidelor, lipoproteinelor și aterosclerozei centrelor de fenotipare metabolică a șoarecelui Vanderbilt.

Imunohistochimie.

Ficatele provenite de la animalele moarte au fost înghețate în azot lichid, încorporate într-un compus de tăiere cu temperatură optimă și tăiate în secțiuni de 6 μm. Colorarea hematoxilinei/eozinei și a uleiului-roșu-O a fost efectuată folosind tehnici standard.

Analiza lipidelor hepatice.

Analiza lipidelor hepatice a fost efectuată de nucleul lipidelor, lipoproteinelor și aterosclerozei centrelor de fenotipare metabolică a șoarecelui Vanderbilt. Lipidele au fost extrase, filtrate și recuperate în faza de cloroform. Clasele individuale de lipide au fost separate prin cromatografie în strat subțire folosind plăci de silicagel 60 A și vizualizate cu rodamină 6G. Fosfolipidele, trigliceridele și esterii colesterolului au fost răzuite, metilate și analizate prin cromatografie gazoasă (16,17).

Microarrays oligonucleotidice.

ARN total (25 μg) a fost combinat de la două la trei animale pentru a produce ARNc așa cum s-a descris anterior (18). ARNc (15 μg) a fost hibridizat pe cipurile murine Affymetrix U74Av.2, cu patru cipuri reprezentând fiecare grup. Datele au fost analizate folosind MAS v5, fiecare cip fiind normalizat la o intensitate medie de 1.500.

PCR în timp real.

ARN total a fost extras și purificat folosind kitul RNeasy (Qiagen) și utilizat pentru a direcționa sinteza ADNc folosind kitul RT pentru PCR (Clontech). RT-PCR a fost efectuat utilizând SYBR green master mix (ABI), 5% din reacția de sinteză a ADNc și 300 nmol/l din primerii relevanți. Proteina de legare a elementelor de reglare a sterolului (SREBP) -1c și primerii SREBP-1a au fost specifici izoformei și au fost descriși anterior (19). Alți primeri au fost după cum urmează: supresorul citokinelor de semnalizare (SOCS) -3, 5'-CCTCGGGGACCATAGGAG-3 'și 5'-AACTTGCTGTGGGTGACCAT-3'; SREBP-2, 5'GCGTTCTGGAGACCATGGA-3 'și 5'-ACAAAGTTGCTCTGAAAACAAATCA-3'; receptor activat de proliferator peroxizom-γ coactivator (PGC) -1α, 5′-GTCAACAGCAAAAGCCACAA-3 ′ și 5′-TCTGGGGTCAGAGGAAGAGAg-3 ′; și PGC-1β, 5'-CCCTGTCCGTGAGGAACG-3 'și 5'-ATCCATGGCTTCGTACTTGC-3'. Primerii s-au descoperit că se amplifică liniar. Deoarece gene comune de menaj, cum ar fi proteina de legare TATA și proteina ribozomală 36B4, au variat între tulpini, expresia a fost normalizată la intrarea ARN și calculată ca o funcție de 2 -Ct .