Efectele anti-obezitate ale Tongbi-san într-un model de șoarece obez indus de o dietă bogată în grăsimi, model BMC
Abstract
fundal
Recent, s-a observat că medicamentele pe bază de plante naturale pot fi eficiente în tratarea obezității. Tongbi-san (TBS) este un medicament tradițional utilizat de obicei pentru disurie (adică urinarea dureroasă), conținând trei plante medicinale, Cyperus rotundus L., Citrus unshiu Markovich și Poria cocos. În acest studiu, ne-am propus să examinăm dacă TBS poate inhiba adipogeneza indusă de dieta bogată în grăsimi (HFD) în ficat și țesutul adipos epididimal al șoarecilor obezi.
Metode
Șoarecii masculi C57BL/6 N au fost hrăniți cu o dietă normală, un HFD, un HFD plus orlistat 10 sau 20 mg/kg sau un HFD plus TBS 50 sau 100 mg/kg timp de 11 săptămâni. Greutatea corporală a fost verificată săptămânal și s-au investigat examinările histologice ale țesuturilor. De asemenea, a fost evaluată o expresie a genelor implicate în adipogeneză.
Rezultate
Administrarea orală de TBS a redus semnificativ greutatea corporală și a scăzut greutatea țesutului adipos alb epididimal și visceral (WAT). În plus, am constatat că TBS a îmbunătățit expresia protein kinazei activate cu adenozină monofosfat (AMPK) și a inhibat expresia factorilor de transcripție, cum ar fi CCAAT/proteinele care leagă amplificatorul (C/EBPs), proteina 1 care leagă elementul de reglare a sterolului ( SREBP1) și receptorul activat de proliferatorul peroxizomului γ (PPARγ) în ficat și epididimal WAT măsurat prin reacție în lanț cantitativă a polimerazei cu transcripție inversă (qRT-PCR).
Concluzie
Aceste descoperiri demonstrează că efectele anti-obezitate ale TBS pot fi legate de activarea AMPK.
fundal
Obezitatea se caracterizează printr-o creștere excesivă a masei țesutului adipos și devine rapid o problemă de sănătate publică care afectează milioane de oameni din întreaga lume [1]. Țesutul adipos a fost considerat a fi un regulator principal al homeostaziei energetice [2]. Datorită unui dezechilibru între consumul și consumul de energie, obezitatea dă naștere unei creșteri excesive și a expansiunii țesutului adipos [3]. Țesutul adipos alb (WAT) este un organ endocrin complex compus din diferite depozite, inclusiv depozite WAT subcutanate (de exemplu, inghinale) și intra-abdominale (de exemplu, epididimale și mezenterice) [4]. WAT este extins în mod corespunzător pentru a stoca surplusul de energie, cu toate acestea, în timpul obezității, acesta poate deveni grav disfuncțional și poate eșua pentru aceste funcții. Expansiunea WAT nesănătoasă a fost corelată cu numeroase rezultate dăunătoare, cum ar fi inflamația, hipoxia, fibroza și funcția mitocondrială perturbată [5]. Astfel, inhibarea măririi țesutului adipos poate fi o țintă importantă pentru a preveni și trata obezitatea.
Procesul prin care sunt generate adipocitele mature, adipogeneza, este foarte reglementat de factori transcripționali, inclusiv CCAAT/proteina de legare a amplificatorului α (C/EBPα), receptorul activat proliferator al peroxizomului γ (PPARγ) și proteina 1 de legare a elementului de reglare a sterolului (SREBP1 ) [6, 7]. PPARγ este exprimat în mod specific în țesutul adipos și acționează ca un regulator principal în diferențierea adipocitelor și metabolismul glucozei [8]. C/EBPα este puternic exprimat în țesutul adipos și ficatul atât al rozătoarelor, cât și al oamenilor [9] și s-a raportat că șoarecii knock-out C/EBPα se avortează pentru a acumula lipide în adipocite [10]. SREBP ajustează expresia multor enzime implicate în sinteza colesterolului, acizilor grași, triacilglicerolilor și fosfolipidelor. În consecință, SREBP reglează lipogeneza celulară și homeostazia lipidelor [11]. SREBP-urile sunt împărțite în trei izoforme: SREBP-1a, SREBP-1c și SREBP2 [12]. SREBP-1 controlează în principal expresia genelor implicate în metabolismul acizilor grași și triacilglicerolului, în timp ce SREBP-2 reglează în principal metabolismul colesterolului [13].
Protein kinaza activată cu adenozină monofosfat (AMPK) este un senzor principal de energie, definit ca o proteină kinază activată printr-o creștere a raportului de energie AMP/ATP [14]. AMPK este, de asemenea, o enzimă heterotrimerică care joacă un rol principal în homeostazia energetică a țesutului adipos [15] și este asociată cu reglarea C/EBPα și PPARγ [16]. În plus, SREBP1 este, de asemenea, reglementat negativ de AMPK [17]. În consecință, este probabil ca expresia AMPK să fie o țintă latentă a genei pentru suprimarea adipogenezei. În acest studiu, am emis ipoteza că activarea AMPK poate juca un rol decisiv într-un model de șoarece indus de o dietă bogată în grăsimi (HFD) prin inhibarea C/EBPα, PPARγ și SREBP1, suprimând astfel adipogeneza.
Metode
Substanțe chimice și reactivi
TBS constă din C. rotundus L., C. unshiu Markovich și Poria cocos. Cele trei plante au fost cumpărate de la Nanum Pharmaceutical Company (Seul, Republica Coreea). Probele de plante au fost efectuate pentru testul senzorial în conformitate cu „The Korean Herbal Pharmacopeea” de Prof. Yun-Yeop Cha și doar cele care au trecut standardul coreean de farmacopee au fost selectate și utilizate pentru acest experiment. TBS a fost realizat folosind un raport 1: 1: 1 al acestor plante (400 g fiecare). Ierburile au fost apoi extrase în apă la 99 ° C timp de 3 ore. Extractul a fost liofilizat, iar rata randamentului a fost calculată la 33,20% (33,20 g la 100 g de extract lichid). Pulberea a fost dizolvată în apă distilată pentru acest experiment, iar pulberea reziduală a fost depozitată la - 20 ° C. HFD de 30% a fost obținut de la Research Diets (New Brunswick, NJ, SUA). Anticorpii p-AMPK și AMPK au fost obținuți de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA). Primii oligonucleotidici PPARγ, C/EBPα, SREBP1, AMPK și gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) au fost achiziționați de la Bioneer Corporation (Daejeon, Republica Coreea), iar SYBR Premix Ex Taq a fost achiziționat de la Takara Bio Inc. (Otsu, Japonia). Orlistat a fost achiziționat de Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokyo, Japonia) și alți reactivi au fost cumpărați de la Sigma-Aldrich Co. LLC (St. Louis, MO, SUA).
Modelul de șoarece obezitate indusă de HFD
Analiza serului
La sfârșitul fiecărui experiment, probele de sânge ale șoarecilor tratați au fost colectate și centrifugate la 1000 ×g timp de 20 min. Concentrația serică colectată a fost utilizată pentru a determina colesterolul total (TC), azotul uree din sânge (BUN), aspartat aminotransferaza (AST) și alanina aminotransferaza (ALT) utilizând metode enzimatice din kiturile disponibile comercial (BioVision; Milpitas, CA, SUA).
Analiza histologică
Ficatul și țesutul adipos epididimal de la un șoarece reprezentativ din fiecare grup au fost fixate în formalină tamponată 10%, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni groase de 8 μm. Unele secțiuni au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) pentru examinarea histologică a picăturilor de lipide și imaginile au fost obținute cu ajutorul unui microscop Olympus SZX10 (Tokyo, Japonia).
Analiza Western blot
Segmente de ficat sau țesut adipos epididimal au fost suspendate în soluția de extracție a proteinelor PRO-PREP ™ (Intron Biotechnology, Seoul, Republica Coreea) și incubate timp de 20 de minute la 4 ° C. Resturile celulare au fost îndepărtate prin micro-centrifugare, urmată de înghețarea rapidă a supernatantului. Concentrația de proteine a fost determinată utilizând reactivul de testare a proteinelor Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Proteinele celulare din extracte de celule tratate și netratate au fost electroblotate pe o membrană de fluorură de poliviniliden după separare prin 10-12% SDS-PAGE. Blotul a fost incubat timp de 1 oră cu soluție de blocare (lapte degresat 5%) la temperatura camerei, urmată de incubare peste noapte cu anticorp primar (1: 1000) la 4 ° C. Bloturile au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată Tween 20/Tris (T/TBS) și incubate cu anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean (1: 2000) timp de 2 ore la temperatura camerei. Bloturile au fost din nou spălate de trei ori cu T/TBS și apoi dezvoltate prin chemiluminescență îmbunătățită (GE Healthcare, Waukesha, WI, SUA). Analiza densitometrică a fost efectuată utilizând software-ul Bio-Rad Quantity One.