Edaravone oferă neuroprotecție într-un model de accident vascular cerebral diabetic prin inhibarea reticulului endoplasmatic

Laborator de neurofarmacologie moleculară, Departamentul de farmacologie și toxicologie, Institutul Național de Educație și Cercetare Farmaceutică (NIPER), Punjab, India

Abstract

Deși potențialul neuroprotector al EDR a fost investigat mai devreme, din cunoștințele noastre, nu există niciun raport care să descrie efectul neuroprotector al EDR într-un model de șobolan de leziuni focale I/R cerebrale asociate cu diabetul de tip 2 comorbid. În prezenta investigație, am testat dacă EDR ar fi, de asemenea, eficient împotriva accidentului vascular cerebral diabetic prin suprimarea stresului ER crescut/moartea celulelor apoptotice. Acest studiu are, de asemenea, semnificație, având în vedere recomandarea actualizată a mesei rotunde a industriei academice de terapie cu AVC (STAIR, 2009), care consolidează faptul că experimentele vor fi efectuate și pe modele animale cu condiții comorbide pentru o mai mare relevanță clinică și o mai bună traducere a eficacității compușilor testați din modelele preclinice la studii clinice [19].

Materiale și metode

Animale. Șobolani Sprague - Dawley masculi (120-140 g) au fost procurați de la unitatea centrală pentru animale a institutului. Șobolanii au fost hrăniți cu hrană regulată pentru pelete (Ashirwad Industries, Chandigarh) și apă potabilă ad libitum. Experimentele au fost permise în mod corespunzător de către comitetul instituțional de etică a animalelor (IAEC), NIPER și efectuate în conformitate cu liniile directoare ale comitetului în scopul controlului și supravegherii experimentelor pe animale (CPCSEA), Guvernul Indiei.

Inducerea diabetului de tip 2 la șobolani. Inducerea diabetului de tip 2 a fost efectuată la șobolani printr-o combinație de hrană cu dietă bogată în grăsimi (HFD) și doză mică de streptozotocină (STZ; Sigma, St. Louis, MO, SUA), după cum sa descris anterior [20]. Pe scurt, șobolanii au fost hrăniți cu HFD timp de 2 săptămâni și apoi au devenit diabetici printr-o singură doză mică de tratament STZ (35 mg/kg, i.p.). Probele de sânge au fost colectate inițial și la sfârșitul celor 4 săptămâni. Diferiții parametri biochimici, cum ar fi glucoza plasmatică, trigliceridele și nivelurile totale de colesterol, au fost măsurați folosind truse colorimetrice disponibile în comerț (Accurex India Pvt Ltd, Mumbai, India). Insulina plasmatică a fost determinată folosind un kit ELISA (Linco Research, St. Charles, MO, SUA). Doar șobolanii cu un nivel plasmatic de glucoză> 300 mg/dl la sfârșitul săptămânii 4 au fost considerați diabetici și incluși în studiu.

Pregătirea și tratamentul medicamentelor. EDR (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, SUA) (1, 3 și 10 mg/kg), un puternic agent de eliminare a radicalilor liberi, a fost dizolvat în soluție de NaOH 1 N și neutralizat cu HCl 1 N pentru a ajusta pH-ul la 7,4 la doză volum de 2 ml/kg. EDR a fost administrat intraperitoneal (i.p.) imediat (în decurs de 2 minute) după MCAO. Dozele de EDR au fost selectate pe baza unui raport de literatură [16]. Potențialul neuroprotector al EDR a fost evaluat atât din studiile histologice, cât și din cele neurologice funcționale, după 22 de ore de reperfuzie, după cum este descris mai jos, comparativ cu tratamentul vehiculului.

Evaluarea deficitelor neurologice funcționale. Deficitul neurologic a fost evaluat după 22 de ore de reperfuzie, după cum sa raportat mai devreme [21]. Descoperirile neurologice au fost notate pe o scară de cinci puncte. Fără deficit neurologic = 0, eșecul extinderii labei drepte complet = 1, încercuind dacă este tras de coadă = 2, încercuire spontană = 3 nu a mers spontan și a avut un nivel de conștiință deprimat = 4.

Estimarea infarctului cerebral și a volumului de edem. Șobolanii au fost uciși la 22 de ore după reperfuzie pentru estimarea infarctului cerebral și a volumului edemului. Creierele au fost tăiate în secțiuni coronare groase de 2 mm și colorate cu soluție 2% 2,3,5 - clorură de trifeniltetrazoliu (TTC), iar aria infarctului și volumul edemului au fost măsurate folosind software-ul de analiză a imaginii (Leica Qwin, Wetzlar, Germania) după cum sa raportat anterior [23]. Pe scurt, zonele de infarct ale tuturor secțiunilor creierului au fost cumulate pentru a ajunge la aria totală a infarctului care a fost înmulțită cu grosimea secțiunilor creierului pentru a ajunge la volumul de infarct. Corecția edemului volumului infarctului a fost efectuată folosind formula, corectarea volumului = (volumul infarctului × volumul contralateral)/volumul ipsilateral. Au fost calculate volumele ambelor emisfere din care s-a calculat volumul edemului prin scăderea volumului contralateral din volumul ipsilateral.

Estimarea fragmentării ADN-ului. Testarea terminală de marcare a deoxinucleotidil transferazei (TUNEL) a fost efectuată pentru a identifica gradul de fragmentare a ADN-ului în secțiunea creierului încorporat în parafină, așa cum a fost descris anterior [23]. Capătul 3 ′ al ADN-ului fragmentat a fost marcat folosind kitul de detectare a fragmentării ADN - TdT - FragEL conform instrucțiunilor producătorului (Merck, SUA). Celulele pozitive TUNEL au fost numărate din regiunea penumbrală a secțiunilor creierului și exprimate ca procent de celule pozitive TUNEL comparativ cu celulele totale.

Imunohistochimie. Analiza imunohistochimiei (IHC) pentru in situ expresia diferitelor proteine de stres ER, cum ar fi GRP78 și CHOP/GADD153, a fost efectuată așa cum s-a descris anterior folosind kitul ABC pentru colorare Vecta (Vector Labs, Burlingame, CA, SUA) [24]. Marcarea specifică a fost detectată folosind diaminobenzidină ca substrat. Secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină și observate la microscopul cu lumină (Leica) peste regiunea ipsilaterală penumbrală, iar imaginile au fost achiziționate cu o cameră CCD (Leica). Deoarece GRP78 este o proteină constitutivă, imunoreactivitatea a fost măsurată pe baza modelului de notare imunohistochimică. Scorarea IHC a fost efectuată pe baza intensității colorării după cum urmează: 1 - culoare ușoară sau deloc; 2 - colorare foarte scăzută; 3 - colorare moderată; și 4 - colorare foarte intensă. Cu toate acestea, CHOP/GADD153 este o proteină inductibilă care este reprezentată cantitativ ca procent de celule pozitive CHOP/GADD153 colorate maro închis comparativ cu celulele totale.

Western blot. Western blot a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [25]. Pentru analiza Western blot, alicote care conțin cantități egale de proteine au fost încărcate în fiecare godeu și supuse la 10-12% SDS - PAGE. Proteinele separate au fost transferate pe membrană de nitroceluloză și blocate cu 3% albumină serică bovină timp de 2 ore. Membranele au fost apoi testate pentru proteina GRP78 sau caspaza-12 prin incubarea cu anticorpii primari precum GRP78 (1: 500, Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, SUA) sau caspaza-12 (1: 1000; Semnalizare celulară, Davers, MA, SUA) urmată de incubație cu anticorp secundar conjugat cu fosfatază alcalină (AP) (1: 5000, Sigma, SUA) timp de 2 ore la temperatura camerei. Bloturile au fost vizualizate prin reacție enzimatică prin incubare cu un amestec de 5-brom-4-clor-3-indolil fosfat (BCIP) și nitro albastru tetrazol la temperatura camerei. Încărcarea egală a proteinelor a fost confirmată prin măsurarea β‐ actinei. Analiza densitometrică a fost efectuată utilizând software-ul de analiză NIH ImageJ. Valorile au fost normalizate cu β‐ actină.