Dezvoltarea unui nou model de constipație a șoarecilor
Corespondență cu: Bin Xu, dr., Profesor, Laboratorul cheie de acupunctură integrată și medicamente afiliate la Ministerul Educației din China, Universitatea de Medicină Chineză din Nanjing, nr. 1338 Xianlin Road, Nanjing 210023, provincia Jiangsu, China. moc.anis@xuuuux
Telefon: + 86-25-86798095 Fax: + 86-25-86798095
Abstract
SCOP: Stabilirea unui nou model de constipație a șoarecilor.
METODE: Animalele au fost împărțite aleatoriu în trei grupuri și administrate intragastric 0-4 ° C ser fiziologic (grup rece cu gheață) sau 15-20 ° C ser fiziologic (grup martor salin) zilnic timp de 14 zile sau au fost lăsate netratate (grup martor gol )). Scaunele au fost colectate la 3-24 ore după tratament pentru a înregistra greutățile umede și uscate și forma scaunului. Au fost efectuate experimente de propulsie intestinală și timpul de defecare a fost măsurat timp de șase zile continuu după suspendarea tratamentelor. Expresiile PGP9.5 au fost detectate de imunohistochimie.
REZULTATE: Pe baza procentului de modificări ale greutății scaunului comparativ cu valoarea inițială (înainte de iritare) în 9-14 zile, modificările greutății scaunului au fost clasificate în trei niveluri. Fiecare nivel arată o stare corporală diferită, care este starea I (fără modificări: plus sau minus 5%), starea II (ușor scăzută: 5% -15%) și starea III (scăzută: 15% -25%). În starea III, între ziua 9-14, greutățile scaunelor au scăzut cu 15% -25% comparativ cu valoarea inițială și s-au modificat cu o rată> 10% comparativ cu valorile martorului gol, iar scaunele au devenit mici și uscate. În plus, funcțiile intestinale au degenerat la aceste animale, iar expresia pozitivă a PGP9.5 a scăzut semnificativ în jejun, ileon și plexul mienteric de colon proximal.
CONCLUZIE: Iritarea cu soluție salină rece ca gheața este o metodă stabilă, repetabilă în construirea modelului de constipație la șoareci pentru explorarea opțiunilor de patogeneză și tratament ale constipației, iar schimbarea greutății și mărimii scaunului poate servi ca instrument util pentru a judeca succesul modelului de constipație sau nu.
Tipul de bază: Stabilirea de modele animale stabile este foarte importantă pentru studierea patogeniei bolii pentru a dezvolta strategii de prevenire și tratament. Dovezile din cercetările anterioare au arătat că iritarea recurentă și cronică a apei reci la nivelul stomacului poate inhiba motilitatea gastro-intestinală. În acest studiu, am concluzionat că iritarea cu soluție salină rece ca gheața la șoareci este o metodă stabilă, repetabilă în construirea modelului de constipație a șoarecilor.
INTRODUCERE
Constipația, care însoțește diferite boli, este un simptom al defectelor care stau la baza fie în tranzitul masei fecale prin intestin, fie în defecație, o tulburare gastrointestinală funcțională diagnosticată frecvent. Se asociază de obicei cu tulburări de motilitate gastro-intestinală, care se caracterizează printr-o serie de simptome gastro-intestinale complexe în absența obstrucției mecanice a tractului gastro-intestinal. În general, se acceptă faptul că afectarea motilității gastro-intestinale și a paresteziei viscerale formează baza patologică și fiziologică majoră a disfuncției gastro-intestinale [1-3]. Având în vedere insuficiența datelor clinice disponibile, sunt necesare modele animale pentru a studia patogenia constipației și a dezvolta strategii de prevenire și tratament și este necesar să se dezvolte și modele optimizate [4].
În ultimii ani, multe abordări au fost utilizate pentru a produce constipație la animale experimentale in vivo. Cu toate acestea, cea mai mare parte a muncii a fost efectuată la șobolani. În comparație cu șobolanii, șoarecii au o toleranță mai mică și nu li se pot administra medicamente iritante pe termen lung. Cercetarea la șoareci oferă multiple avantaje, inclusiv eficiența economică și disponibilitatea unui număr mai mare de tulpini de rasă pură sau manipulate genetic (transgenice și knockout). Mai mult, trăsăturile anatomice murine și dezvoltarea embrionară sunt similare cu cele ale oamenilor, iar genomurile prezintă, de asemenea, un grad ridicat de omologie [5]. Modelele de șoareci oferă o versatilitate mai mare pentru studiul funcțiilor genelor umane și patogeneza bolii decât modelele de șobolani. Prin urmare, în acest studiu, ne-am propus să producem un model stabil de constipație la șoareci, să studiem patogeneza constipației și să explorăm opțiuni de tratament mai bune.
MATERIALE ȘI METODE
Animale
Șoarecii C57BL/6J (mascul SP-grade, mascul de 3 săptămâni, 20-25 g) au fost achiziționați de la Centrul de Cercetare Animal Model al Universității Nanjing (Nanjing, China, număr de licență: SCXK 2013-0005). Hrana și apa erau disponibile ad libitum, iar animalele erau găzduite în condiții de mediu controlate. Toate manipulările experimentale au fost întreprinse în conformitate cu Principiile de îngrijire a animalelor de laborator și Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, publicat de National Science Council, China.
Grupuri și tratamente
Șoarecii au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri: un grup tratat cu soluție salină 0-4 ° C (grup rece cu gheață, n = 30), un grup normal de hrănire (martor gol, n = 10) și un 15-20 ° C grup tratat cu soluție salină (martor salin, n = 10), numerotat aleatoriu și crescut în cuști individuale care permiteau accesul normal la alimente și apă. Plasa de sârmă a fost utilizată pentru a facilita separarea și colectarea scaunelor. Pentru a elimina influența ritmurilor biologice, administrările intragastrice au fost efectuate la 8:00 o dată pe zi timp de 14 zile. Șoarecii din grupurile martor răcite cu gheață și saline au fost inițial administrate fie cu gheață, fie cu soluție salină la temperatura camerei, respectiv, la o doză de 0,2 ml/șoarece, iar apoi doza a crescut cu 0,05 ml/șoarece la fiecare 5 zile. Șoarecii martor martor au fost crescuți în mod normal fără administrare intragastrică. Animalele au fost crescute și monitorizate în mod normal timp de încă 6 zile după încetarea administrărilor intragastrice.
Colectarea și examinarea scaunului
În perioada de 3-24 ore după administrarea intragastrică, scaunul a fost colectat cu cupe ceramice. După colectare, modificările în forma scaunului (dimensiunea peletei) au fost observate și înregistrate înainte de cântărire. Apoi, fiecare cană ceramică a fost cântărită pentru a determina greutatea umedă utilizând o balanță electronică. După uscare într-un cuptor cu microunde (căldură medie) timp de 6 minute, cana a fost cântărită din nou pentru a determina greutatea uscată.
Măsurarea funcției intestinale
Pregătirea țesuturilor
Când s-a terminat intervenția de 14 zile, intestinul subțire (jejun și ileon) și specimenele de țesut de colon proximal (aproximativ 1 cm lungime) au fost îndepărtate după 12 ore de post. Fiecare segment a fost deschis de-a lungul marginii mezenterice și spălat de două ori în soluție salină. Când țesuturile mezenterice și conținutul intestinului au fost îndepărtate, segmentele au fost imediat fixate prin imersiune în 4% Para formaldehidă timp de 24 de ore. Apoi, au fost prelucrate pentru încorporarea parafinei în vid și tăiate la o grosime de 10 μm.
Imunohistochimie
Secțiunile au fost deparafinizate în xilen și hidratate într-o soluție gradată de etanol. Activitatea peroxidazei endogene a fost blocată cu 3% peroxid de hidrogen. După trei clătiri în soluție salină tamponată cu fosfat 0,01 mol/L (PBS; pH 7,2), legarea nespecifică a fost blocată cu 5% albumină serică bovină (BSA) timp de 30 de minute la 37 ° C. Anticorpii primari pentru PGP9.5 (1: 1000) au fost aplicați pe secțiuni și fiecare specimen a fost incubat într-o cameră umedă peste noapte la 4 ° C. Diapozitivele au fost spălate de trei ori în PBS și incubate cu hreanperoxidază (HRP) -Polimer anti-șoarece/iepure lgG timp de 90 de minute la 37 ° C. După spălare în PBS de trei ori, localizarea proteinei țintă a fost vizualizată prin incubarea secțiunilor timp de 5-10 minute în soluție de 3,3-diaminobenzidină proaspăt preparată (DAB). Lamele au fost spălate din nou, contracolorate în hematoxilină și deshidratate. Specificitatea anticorpului a fost confirmată prin control negativ în absența tratamentului cu anticorpi primari. Doi observatori au evaluat lamele folosind un microscop optic Olympus FV500 (Olympus, Tokyo, Japonia). Imunocolorarea pozitivă a fost evaluată la 5 câmpuri vizuale aleatorii la o mărire de 400. Densitatea medie a expresiei pozitive a fost evaluată utilizând software-ul de analiză a imaginii.