Dentigerumicina este un mediator bacterian al unei simbioze antifungice Natură Biologie chimică
Abstract
Furnicile care cultivă ciuperci se angajează în asociații mutualiste atât cu ciuperca pe care o cultivă pentru hrană, cât și cu actinobacteriile (Pseudonocardia spp.) care produc antibiotice selective pentru a apăra acea ciupercă de paraziții fungici specializați. Am analizat un astfel de sistem la nivel molecular și am constatat că bacteria asociată cu furnica Apterostigma dentigerum produce dentigerumicină, o depsipeptidă ciclică cu aminoacizi foarte modificați, pentru a inhiba selectiv ciuperca parazitară asociată (Escovopsis sp.).
Am început prin izolarea bacteriei (Pseudonocardia sp.), cultivarul fungic și ciuperca parazităEscovopsis sp.) de la o furnică (Apterostigma dentigerum) cuib colectat în Gamboa, Panama în 2001 (codul coloniei CC011120-4, vezi Metode suplimentare online; Fig. 1a). Pseudonocardia tulpina izolată din cuticula A. dentigerum inhibă puternic Escovopsis izolat obținut din aceeași colonie (Fig. 1b), în timp ce cultivarul fungic este relativ rezistent la tulpina bacteriană (Fig. 1 suplimentară online). Analiza inițială LC/MS atât a unui extract de acetat de etil dintr-o cultură lichidă întreagă, cât și a unui extract de metanol dintr-o cultură de placă de agar din Pseudonocardia tulpina a dezvăluit prezența unei singure componente majore (Fig. suplimentară 2 online). O investigație ulterioară, care implică cultivarea la scară largă (8 l) și fracționarea ghidată de testare prin coloană flash C18 și HPLC, au confirmat că acest compus major, pe care l-am numit dentigerumicină (1, FIG. 2a), este responsabil pentru Escovopsis inhibitie.
(A) Apterostigma furnică cultivatoare de ciuperci (codul coloniei CC011120-4), care arată un lucrător al Apterostigma dentigerum. () Demonstrarea bio-testului în perechi demonstrează in vitro inhibarea ciupercii parazitare Escovopsis (sus și jos) de Pseudonocardia (centru) (placa de agar cu diametrul de 8,5 cm).
(A) Structura dentigerumicinei (1) conține unități de aminoacizi foarte modificate, cum ar fi acizii piperazici. () Curba susceptibilitate doză-răspuns reprezentând concentrația logaritmică a dentigerumicinei în μM față de densitatea celulară fungică (unitate de fluorescență) a Escovopsis, demonstrând inhibarea ciupercii parazitare de către dentigerumicină cu un MIC de 2,8 μM. Barele de erori arată s.d.
Dentigerumicina a fost izolată sub formă de pulbere albă având formula moleculară C40H67N9O13, determinată prin spectrometrie de masă ESI-TOF de înaltă rezoluție cuplată cu date spectrale 1H și 13C RMN (Tabel suplimentar 1 și Fig. Suplimentar 3 online). Spectrul 1 H RMN a afișat 1 proton singlet în jos la 9,50 p.p.m., 2 protoni dublet amidă și 12 protoni între 4 și 6 p.p.m. Spectrele RMN 13 C și gHSQC au arătat 7 carboni amilici sau ester carbonilici, 5 carboni purtători de oxigen, 9 carboni purtători de azot și 19 semnale carbon alifatice. Analiza datelor spectrale gHSQC a permis atribuirea tuturor corelațiilor cu o legătură de carbon și protoni și a identificat nouă protoni atașați la heteroatomi.
Interpretarea spectrelor RMN gCOSY, TOCSY, gHSQC și gHMBC atribuite șase substructuri derivate din aminoacizi și o substructură derivată din polichide. Acestea includ două unități de acid piperazic (Pip-1 și Pip-2), acid γ-hidroxipiperazic (γ-OH-Pip), β-hidroxileucină (β-OH-Leu), -hidroxialanină (-OH-Ala), alanină și un lanț lateral acil purtător de piran (Fig. 2a și Fig. Suplimentară 4a online). Corelațiile cheie HMBC au asigurat secvența unităților de aminoacizi și lanțul lateral acil (Fig. Suplimentară 4b), care a completat structura plană a dentigerumicinei (Fig. 2a). Am determinat stereochimia dentigerumicinei folosind o combinație de analize spectroscopice, reacții degradative și derivatizări, așa cum se arată mai jos. Configurația relativă a inelului piranic în lanțul lateral acil a fost determinată de corelații ROESY (Fig. Suplimentară 5a online). Configurația relativă a celor două centre stereogene consecutive în β-OH-Leu a fost stabilită ca 23 * și 24 * de .-analiza configurației bazate pe 8 (Fig. suplimentară 5b). Configurația relativă a acidului γ-hidroxipiperazic a fost determinată ca (5 *, 7 *) -γ-OH-Pip prin constanta de cuplare 1 H- 1 H și analiza spectrală ROESY 9 (Fig. suplimentară 5c).