Deficiența factorului de creștere a fibroblastilor 21 agravează răspunsurile atrofice induse de obezitate în schelet

Abstract

fundal

Inflamația mușchilor scheletici indusă de obezitate este un factor major la pierderea/atrofierea mușchilor scheletici și este implicată în complicații metabolice, cum ar fi rezistența la insulină. Se știe că factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21) este un important regulator metabolic cu proprietăți antiinflamatorii. Cu toate acestea, efectul FGF21 asupra atrofiei mușchilor scheletici este neclar. În acest studiu, am investigat efectul deficitului de FGF21 asupra inflamației și atrofiei mușchilor scheletici indusă de obezitate la șoareci.

Rezultate

Expresia factorilor atrofici (MuRF1 și Atrogin-1) a fost reglată în sus la nivelurile de mARN și/sau proteine din mușchiul scheletic al șoarecilor obezi deficienți în FGF21 comparativ cu șoarecii obezi de tip sălbatic. Acest lucru a fost însoțit de o creștere a nivelurilor de citokine inflamatorii (TNFα și MCP-1) și o reducere a fosforilării AMPK. Tratamentul cu FGF21 a suprimat în mod semnificativ răspunsurile inflamatorii și atrofice mediate de TNFα în miotuburile cultivate, iar acțiunile FGF21 au fost tocite de compusul inhibitor AMPK C.

Concluzie

Aceste constatări sugerează că deficitul de FGF21 agravează inflamația indusă de obezitate și răspunsurile atrofice la nivelul mușchiului scheletic al șoarecilor obezi, iar FGF21 poate proteja atrofia mediată de inflamație prin calea AMPK.

fundal

Obezitatea este strâns asociată cu pierderea/atrofia masei musculare scheletice denumită sarcopenie, care contribuie la fragilitate/dizabilitate fizică [1, 2] și la complicații metabolice, cum ar fi rezistența la insulină și diabetul de tip 2 [3]. Inflamația mușchilor scheletici indusă de obezitate, caracterizată prin niveluri crescute de citokine inflamatorii, cum ar fi factorul de necroză tumorală α (TNFα) și interleukina-6 (IL-6), promovează un dezechilibru în sinteza și degradarea proteinelor musculare care duc la atrofia musculară [4]. În special, sistemul ubiquitin-proteazom, o cale majoră de degradare a proteinelor, este cunoscut ca fiind esențial pentru risipa musculară: sistemul degradează proteinele musculare în peptide mici, inclusiv atrofia musculară F-box (MAFbx, numită atrogin-1) și inelul muscular degetul 1 (MuRF1) prin reacții enzimatice dependente de adenozin trifosfat [5,6,7]. Se știe că TNFα induce direct calea ubiquitină-proteazom, prin activarea factorului nuclear-kappa B (NF-κB) în mușchiul scheletic [8, 9]. Cu toate acestea, moleculele implicate în atrofia mușchilor scheletici indusă de obezitate rămân evazive.

În acest studiu, am demonstrat că deficiența FGF21 agravează răspunsurile atrofice induse de obezitate și inflamația în mușchiul scheletic al șoarecilor hrăniți cu HFD. De asemenea, tratamentul cu FGF21 protejează răspunsurile atrofice induse de TNFα în celulele musculare, iar acest lucru a fost inversat de un inhibitor de proteină kinază (AMPK) activat de AMP.

Materiale și metode

Cultura și tratamentul celular

Linia celulară de mioblast murin C2C12 (5 × 105 celule/ml) a fost crescută la 37 ° C în 5% CO2 în DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, SUA) conținând 10% FBS (Life Technologies) și 1% penicilină -streptomicina (Life Technologies). La o confluență de 95-100%, mediul a fost înlocuit cu mediu de diferențiere [DMEM plus 2% ser de cal (Life Technologies)], care a fost schimbat după 2 zile. Pentru a examina efectele FGF21 asupra atrofiei musculare induse de TNFα, miotuburile diferențiate au fost tratate timp de 24 de ore cu 100 ng/ml de TNFα (Pepro Tech), rmFGF21 (Creative Biomart, Shirley, NY, SUA) sau ambele medicamente în combinație. Pentru a examina legătura dintre efectele FGF21 asupra atrofiei musculare induse de TNFα și AMPK, miotuburile C2C12 au fost tratate cu rmFGF21, 20 μM compus C (inhibitor AMPK, Sigma) și/sau 0,5 mM 5-aminoimidazol-4-carboxamidă ribonucleotidă ( AICAR, activator AMPK, Sigma).

Experiment pe animale

Șoarecii cu deficiență de FGF21 de corp întreg (knockout FGF21/KO) pe un fundal C57BL/6 au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME, SUA) și crescuți într-o unitate specifică pentru animale fără patogeni de la Universitatea din Ulsan. Șoarecii masculi cu deficit de FGF21 și tipul lor sălbatic (WT) la vârsta de 7 săptămâni au fost adăpostiți individual în cuști de plastic cu un ciclu de întuneric de 12 ore: 12 ore. Pentru a examina efectele FGF21 asupra atrofiei mușchilor scheletici la obezitate, șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) (60% din calorii ca grăsime din untură de porc și soia; Research Diets, New Brunswick, NJ, SUA) timp de 12 săptămâni și li s-a oferit acces gratuit la alimente și apă. Animalele au fost sacrificate prin asfixiere cu CO2, iar mușchii lor au fost disecați. Toate procedurile și îngrijirea animalelor au fost efectuate conform protocoalelor și liniilor directoare aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Ulsan (LNY-16-020).

Activitatea NF-κB

Activitatea de legare a ADN-ului NF-κB a fost evaluată utilizând un kit NAM-κB p65 TransAM (Active Motif, Rixensart, Belgia). Probele de omogenate tisulare sau miotuburi normalizate pentru conținutul de proteine au fost incubate cu oligonucleotide imobilizate conținând un site de legare consens NF--B. Activitatea de legare a ADN-ului a fost analizată cu anticorpi specifici pentru subunitățile NF-κB conform instrucțiunilor producătorului (motiv activ).

Analiza PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras din miotuburi sau probe de țesut muscular cu tri-reactiv (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA). Două alicote de micrograme de ARN total au fost transcrise invers în ADNc utilizând transcriptaza inversă M-MLV (Promega, Madison, WI, SUA). Amplificarea PCR în timp real a ADNc a fost efectuată utilizând kitul SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, SUA) cu un termic Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Siga, Japonia). Toate reacțiile au fost efectuate conform aceluiași program: 95 ° C timp de 10 s, 45 de cicluri la 95 ° C timp de 5 s și 60 ° C timp de 30 s. Rezultatele au fost analizate folosind software-ul Real Time System TP800 (TaKaRa Bio Inc.) și toate valorile au fost normalizate la nivelurile genei de menaj, β-actină. Primerii utilizați în analiză sunt enumerați în Tabelul 1.