Decoctul Bu-Fei și decoctul modificat Bu-Fei inhibă dezvoltarea cancerului pulmonar cu celule mici,
Date asociate
Disponibilitatea datelor și a materialelor
Seturile de date utilizate și/sau analizate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorul corespunzător, la o cerere rezonabilă.
Abstract
Introducere
Deteriorarea ADN-ului este un factor etiologic important în cancerul pulmonar (1) și există diferite tipuri de leziuni ale ADN-ului, inclusiv modificări ale nucleotidelor (deleții, inserții și substituții ale nucleotidelor), pauze cu un singur fir și pauze cu două fire (2). Când apare deteriorarea ADN-ului, se activează un set de căi de reparare a ADN-ului (3-5). Dintre aceste căi, calea de reparare a exciziei de bază (BER) este responsabilă pentru repararea majorității daunelor ADN cauzate de alchilare și stres oxidativ (4,6).
Endonucleaza 1 apurinică/apirimidinică (AP) 1 (APE1), cunoscută și sub numele de APE, APEX și Ref-1, este o proteină multifuncțională omniprezentă, care este asociată cu activitățile BER și redox. APE1 este o enzimă care limitează viteza în calea BER (7-9). Când apare deteriorarea bazei, glicozilazele din celulă excizează baza deteriorată pentru a genera un site AP sau abasic. Spre deosebire de alte glicozilaze, APE1 este singura enzimă care poate procesa situl abasic al BER; APE1 hidrolizează coloana vertebrală a fosfodiesterului 5 'către locul AP, creând un capăt normal de 3' hidroxil și un capăt de fosfat de dezoxiriboză 5 '. În timpul acestui proces, APE1 recrutează, de asemenea, diverse polimeraze și ligase pentru a participa la reparații. APE1 de mamifere afectează, de asemenea, numeroși factori de transcripție a ADN-ului, inclusiv factorul inductibil al hipoxiei (HIF) -1α, proteina activatoare (AP) -1, factorul nuclear (NF) -κB și p53 (10) și, prin aceasta, contribuie indirect la repararea ADN-ului.
APE1 este singura proteină de reparare a ADN cunoscută ca având activitate de reglare redox (8,10) și este responsabilă pentru 95% din activitatea endonucleazei celulare (7,8). APE1 este capabil să regleze starea reducătoare a reziduurilor de aminoacizi la siturile cheie ale factorilor de transcripție și, prin urmare, participă la diferite evenimente celulare de bază, inclusiv proliferarea, diferențierea, apoptoza și transformarea. Nivelurile de expresie, localizarea subcelulară aberantă și modelele de modificare post-translațională a APE1 au fost implicate în chimioterapie și radiorezistență (11,12) și sunt asociate cu prognostic slab în numeroase tipuri de cancer, inclusiv cancerul pulmonar cu celule mici. (NSCLC) (13-22). Autoanticorpul seric APE1 a fost propus ca un potențial marker tumoral și predictor al răspunsurilor la chimioterapie la pacienții cu NSCLC (23).
Citometrie de flux și analiză a ciclului celular
Celulele au fost resuspendate în RPMI-1640 la o densitate de 3 × 105 celule/godeu în plăci cu 6 godeuri (Costar; Corning Incorporated). Expunerea la medicament a fost efectuată după cultivare timp de 24 de ore și la 1% FBS. Celulele H1975 au fost tratate cu BFD (0-30 mg/ml) sau MBFD (0-15 mg/ml) timp de 24 de ore; Celulele H292 au fost tratate cu BFD (0-30 mg/ml) sau MBFD (0-20 mg/ml) timp de 24 de ore la 37 ° C într-o atmosferă conținând 5% CO2. Celulele au fost apoi colectate, fixate cu etanol rece 75% și depozitate la -20 ° C timp de ≥24 ore. Ulterior, după spălarea de două ori cu PBS rece, celulele au fost incubate cu tampon de colorare cu iodură de propidiu (PI)/RNază (BD Biosciences, San Diego, CA, SUA) timp de 15 minute la temperatura camerei. Conținutul ADN a fost analizat prin citometrie în flux folosind BD Accuri C6 (versiunea 1.0.264.15; BD Biosciences). Procentul de celule din diferitele faze ale ciclului celular a fost determinat folosind software-ul ModFit LT 4.1 (BD Biosciences).
Testul de colorare a anexinei V/PI
Colorarea anexinei V/PI a fost efectuată folosind un kit de detectare a apoptozei (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japonia). După tratament, celulele au fost colectate și dizolvate în 100 μl tampon de legare a anexinei V (5 × 105 celule/ml). La 100 ofl din fiecare probă, s-au adăugat 5 Annexin Annexin V și 5 pl PI, iar probele au fost incubate timp de 15 min la temperatura camerei. Analiza apoptozei a fost efectuată folosind BD Accuri C6. Celulele anexin V-negative/PI-negative au fost identificate ca celule viabile, anexina V-pozitive/PI-negative au fost recunoscute ca celule apoptotice timpurii, iar anexina V-pozitive/PI-pozitive au fost identificate ca celule apoptotice tardive/moarte.
Testul cometei
Celulele au fost suspendate în PBS 1X răcit cu gheață (Ca 2+ - și Mg 2+ -free) la o concentrație de 2 × 105 celule/ml. Rupturile de catenă de ADN au fost evaluate utilizând kitul Trevigen CometAssay ® (Trevigen, Gaithersburg, MD, SUA). Celulele (2 × 105 celule/ml) au fost amestecate cu LMAgaroză topită la un raport de volum de 1:10 și amestecul a fost răspândit imediat uniform pe lamele de cometă, care au fost incubate la 4 ° C în întuneric timp de 10 min. Diapozitivele au fost apoi transferate într-o soluție de liză preîncălzită timp de 60 de minute la 4 ° C.
Pentru testul de cometă alcalină, lamele au fost incubate în 300 mM NaOH conținând 1 mM EDTA (pH> 13) timp de 20 min la temperatura camerei în întuneric și au fost electroforizate la 1 V/cm și 300 mA timp de 40 min. După clătire extinsă, lamelele au fost incubate în etanol 70% timp de 5 minute și uscate. În cele din urmă, ADN-ul a fost colorat cu colorant SYBR-Green I (1: 10.000 în tampon Tris-EDTA, pH 7,5; Trevigen) timp de 20 minute la 4 ° C. Imaginile au fost capturate cu ajutorul unui microscop cu fluorescență (TCS SP5; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania).