Cuantificarea translocației Listeria monocytogenes la șobolani prin utilizarea oxidului nitric derivat din urină
ABSTRACT
MATERIALE ȘI METODE
Cultivarea bacteriilor. L. monocytogenes 4B (izolat clinic, B1242 din colecția institutului nostru) a fost depozitat în mod obișnuit la -80 ° C în bulion de infuzie cardiacă cerebrală (Difco, Detroit, Mich.) Conținând 20% (vol/vol) glicerol. Soluțiile stoc au fost rapid dezghețate, placate pe plăci PALCAM listeria-selective (Merck, Darmstadt, Germania) și apoi incubate aerob la 37 ° C timp de 18 ore. Ulterior, câteva colonii au fost inoculate în bulion de infuzie a inimii creierului, urmată de incubare peste noapte la 37 ° C în condiții aerobe. Celulele bacteriene au fost colectate prin centrifugare (15 min la 3.500 × g), spălate de trei ori în soluție salină sterilă și resuspendate în soluție salină conținând 3% (greutate/vol) bicarbonat de sodiu. Virulența tulpinii utilizate a fost susținută de trecerea orală de rutină la șobolani Wistar, urmată de izolare din splină și ficat în ziua 3 după administrarea orală.
Animale și infecție. Protocolul experimental a fost aprobat de comitetul pentru bunăstarea animalelor de la Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda. Șobolanii masculi Wistar (fără patogeni specifici, WU; Harlan, Horst, Olanda), în vârstă de 9 săptămâni, cu o greutate corporală de aproximativ 325 g, au fost adăpostiți individual în cuști metabolice. Temperatura ambiantă (22 la 24 ° C), umiditatea relativă (50 la 60%) și ciclul de lumină întunecată (lumină, 0600 la 1800 h) au fost menținute constante. Șobolanii au fost hrăniți cu diete purificate constând din 20% cazeină, 63% glucoză, 5% celuloză, 4% ulei de porumb și vitamine și minerale conform recomandării AIN-93 (25), cu excepția colinei, care a fost adăugată sub formă de clorură de colină. în loc de tartrat de colină și calciu, care a fost adăugat sub formă de fosfat de calciu (CaHPO4 · 2H2O; dietă de 180 mmol/kg) în loc de carbonat de calciu (dietă de 125 mmol/kg). Dietele au fost furnizate sub formă de terci cu 68% greutate uscată (diete uscate amestecate cu apă dublu distilată) pentru a reduce la minimum vărsarea alimentelor și contaminarea ulterioară a urinei și a fecalelor. Șobolanilor li s-a oferit acces gratuit la alimente și apă potabilă demineralizată. Aportul alimentar și greutatea corporală au fost înregistrate la fiecare 2 până la 4 zile de preinfecție și postinfecție zilnică.
Statistici. Rezultatele sunt exprimate ca medii ± erori standard (n = 8). Datele au fost verificate pentru normalitate și omogenitate a varianțelor utilizând testul Shapiro-Wilks și respectiv testul lui Levene. Când au fost distribuite în mod normal, diferențele dintre grupuri au fost testate prin analiza varianței (ANOVA), urmat de testul t Student (unilateral) cu corecția Bonferroni pentru comparații multiple. În caz contrar, diferențele dintre grupuri au fost testate cu testul Kruskal-Wallis neparametric. Corelația a fost determinată utilizând momentul produsului Pearson. Diferențele au fost considerate semnificative dacă creșterea șobolanilor P și aportul de alimente. Creșterea în greutate nu a fost afectată de doza de L. monocytogenes administrată. Greutatea corporală medie a fost de 324 g la începutul experimentului, în timp ce greutatea corporală medie finală a fost de 375 g. Aportul alimentar nu a fost afectat în mod semnificativ de doza de L. monocytogenes administrată. Înainte de infecție, aportul mediu de alimente era de 23,1 g/zi. După infecție, aportul mediu de alimente a fost de 21,1 g/zi.
Colonizarea intestinală și translocarea Listeriei. Colonizarea intestinală a fost determinată prin enumerarea celulelor viabile L. monocytogenes în fecale. Figura 1 prezintă cinetica excreției fecale a L. monocytogenes viabil. În ziua 1 după inoculare, au fost excretate niveluri ridicate de listeria. Excreția de L. monocytogenes a scăzut treptat până la limita de detecție în decurs de 1 săptămână după inoculare. Excreția fecală a L. monocytogenes viabil a fost dependentă de doză. Așa cum era de așteptat, nu s-a putut detecta L. monocitogen viabil la fecalele șobolanilor care au primit 8 × 10 9 bacterii ucise de căldură. Nu s-au observat semne clinice de diaree în cursul infecției.