Cuantificarea lipoproteinelor bogate în trigliceride postprandiale la bărbații sănătoși prin ester retinilic

De la Unitatea de Cercetare Ateroscleroza, Institutul de Cercetare King Gustaf V, Departamentul de Medicină, Spitalul Karolinska, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia.

Abstract

Trigliceridele sunt transportate în lipoproteinele plasmatice pentru a furniza energie țesuturilor periferice. În esență, lipoprotein lipaza (LPL) hidrolizează trigliceridele de bază în acizi grași liberi, fie pentru utilizare imediată în mușchi, fie pentru depozitare în țesutul adipos. Cu toate acestea, cealaltă față a monedei poate fi acumularea de particule lipoproteice rămase potențial aterogene. 1 Lipoproteinele cu densitate foarte mică (VLDL) sintetizate în ficatul uman au apoB-100 ca componentă proteică majoră spre deosebire de chilomicronii secretați din intestin după aportul de grăsimi, care au ca proteină structurală apoB-48. Cele două specii de lipoproteine care conțin apoB împărtășesc și concurează pentru aceeași cale lipolitică 2, dar trigliceridele intestinale par a fi substratul preferat pentru LPL. ApoB-48 în chilomicroni și rămășițele acestora se găsesc la o concentrație plasmatică foarte scăzută atât în starea de post cât și în cea postprandială, în timp ce VLDL apoB-100 crește semnificativ după aportul de grăsime, probabil din cauza hidrolizei întârziate. De fapt, o proporție majoră a lipoproteinemiei găsite după aportul de grăsimi este reprezentată de VLDL. Cu toate acestea, s-a demonstrat recent că o creștere a trigliceridelor VLDL reprezintă doar aproximativ 20% din trigliceridele postprandiale. 5

Ingerarea vitaminei A cu grăsimi dă naștere la marcarea esterului de retinil al chilomicronilor. 6 Prin urmare, suplimentarea mesei de test cu vitamina A a fost folosită în mod obișnuit ca mijloc de cuantificare a lipoproteinelor de origine intestinală în starea postprandială. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Cu toate acestea, precizia utilizării vitaminei A în acest context a fost pusă la îndoială. 18 Palmitatul de retinil (RP) a apărut în lipoproteinele probabil endogene în puncte de timp târzii, iar vârful RP a fost întârziat comparativ cu vârfurile trigliceridelor plasmatice și apoB-48 observate după aportul de grăsime. 18

Metode

Subiecte

Bărbații sănătoși cu vârsta cuprinsă între 35 și 45 de ani au fost recrutați dintr-un sondaj de populație care a inclus 160 de subiecți de origine nord-europeană. Un total de 129 din cei 160 de bărbați abordați au fost de acord să dea probe de sânge pentru determinarea de rutină a lipoproteinelor plasmatice în repaus alimentar. Pentru a permite identificarea unui grup omogen de subiecți normolipidemici, s-a efectuat fenotiparea apoE 19, iar percentilele 90 pentru concentrațiile plasmatice de trigliceride VLDL și colesterolul cu lipoproteine cu densitate mică (LDL) au fost utilizate pentru fenotiparea lipoproteinelor. După ce au fost selectați subiecți homozigoti pentru alela ε3 cu trigliceride VLDL plasmatice normale de post și colesterol LDL (sub 1,95 și respectiv 4,70 mmol/L), au rămas un total de 58 de subiecți. Dintre aceștia, 38 au fost selectați aleatoriu pentru prezentul studiu și li s-a cerut să vină pentru un test oral de toleranță la grăsime. Dintre cei 38, 9 au refuzat participarea și 2 nu au putut participa în cele din urmă, ceea ce a lăsat 27 de subiecte pentru prezentul raport.

Sarcina de grăsime orală

Prelevarea de sânge

Probele de sânge venos au fost extrase în tuburi sterile pre-răcite (Vacutainer, Becton Dickinson) conținând Na2EDTA (concentrație finală, 4 mmol/L), care au fost introduse instantaneu în apă cu gheață și protejate de lumină. Plasma a fost apoi recuperată în decurs de 30 de minute prin centrifugare cu viteză redusă (1.750g, 20 minute, 1 ° C) și menținut la această temperatură pe parcursul procedurilor de preparare. Fluorura de fenilmetilsulfonil (10 mmol/L, dizolvată în izopropanol) și aprotinina (1400 μg/ml) (Trasylol, Bayer) au fost adăugate imediat în plasma izolată înainte de fracționarea lipoproteinelor bogate în trigliceride la concentrații finale de 10 μmol/L și 28 μg/ml, respectiv.

Fracționarea lipoproteinelor

Determinarea ApoB-48 și ApoB-100

Determinarea RP

Plasma și fracțiile de lipoproteine bogate în trigliceride au fost protejate de lumină pe tot parcursul procedurii de preparare. Volumele cuprinse între 100 și 250 μL plasmă și fracțiuni lipoproteice bogate în trigliceride au fost extrase cu 4 ml metanol și 4 ml hexan. Faza superioară a fost îndepărtată și solventul a fost evaporat cu un curent ușor de N2. Lipida a fost dizolvată în 200 μL metanol/cloroform (3: 1) și injectată într-un sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță (System Gold, Beckman). RP a fost eluat izocratic cu metanol, iar vârfurile au fost înregistrate prin absorbție UV la 326 nm. Vârfurile au fost integrate cu software-ul System Gold, iar concentrația a fost determinată cu o curbă standard de cinci diluții (7,6 până la 38 nmol) de RP foarte purificat (Sigma R-3375). Recuperarea medie a PR în fracții comparativ cu plasma a fost de 89 ± 15% la 3 ore și 86 ± 17% la 6 ore. La analiza aceluiași eșantion în triplicat, coeficienții de variație au fost de 1,8% pentru o plasmă cu un conținut ridicat (eșantion de 6 ore) și 5,8% pentru o eșantion de plasmă cu un conținut redus (eșantion de 9 ore).

Cifra de afaceri a lipoproteinelor marcate cu RP

Pentru a studia cifra de afaceri a lipoproteinelor bogate în trigliceride marcate cu RP, a fost utilizată o tehnică dezvoltată de Berr și Kern 24 25 cu modificări minore. Cinci bărbați sănătoși au ingerat masa amestecată suplimentată cu vitamina A. Plasmafereza a fost efectuată 4 ore mai târziu pentru a izola aproximativ 0,5 L de plasmă postprandială conținând lipoproteine bogate în trigliceride marcate cu RP. Punga de plasmă a fost depozitată la 4 ° C pe o tavă cu agitare lentă și reinjectată intravenos la 24 de ore după plasmafereză. Subiecții au fost instruiți să ingereze un mic dejun ușor la 7 dimineața, iar perfuzia a avut loc la 11 la 11:30 în acea zi. Infuzia a fost finalizată în decurs de 4 până la 5 minute. Probele de sânge au fost prelevate înainte (trei probe timp de 7,5 minute) și 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 și 360 de minute după terminarea perfuziei. Plasma a fost izolată din probe de sânge și pungi de plasmă, iar concentrația RP în fracțiuni de lipoproteine Sf> 400, Sf 60 până la 400 și Sf 20 până la 60 a fost determinată așa cum s-a descris anterior. Tabelul 1 enumeră caracteristicile celor cinci subiecți supuși plasmaferezei și reinjectării plasmei postprandiale marcate cu RP.

Lipoproteine plasmatice majore

Principalele lipoproteine plasmatice în post (VLDL, LDL și lipoproteine cu densitate mare [HDL]) au fost determinate de o combinație de ultracentrifugare preparativă și precipitare a lipoproteinelor care conțin apoB, urmată de analiza lipidelor. 26 Colesterolul total 27 și trigliceridele 28 au fost determinate în triplicat în plasmă și în fracțiile lipoproteice. Lipidele au fost extrase mai întâi cu cloroform/metanol. 29 Colesterolul și trigliceridele au fost apoi determinate pe un Ultrolab (LKB).