Contribuția microbiotei intestinale la efectele antiinflamatorii mediate de P28GST experimentale și

Benoît Foligné

Coline Plé

2 Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, U1019 - UMR 8204 - CIIL - Centrul pentru Infecție și Imunitate din Lille, F-59000 Lille, Franța; [email protected] (C.P.); [email protected] (C.D.)

Marie Titécat

Arnaud Dendooven

Aurélien Pagny

Catherine Daniel

Elisabeth Singer

Muriel Pottier

Benjamin Bertin

Christel Neut

Dominique Deplanque

3 Univ. Lille, Inserm, CHU Lille, CIC 1403, Centre D’Investigation Clinique, F-59000 Lille, Franța; [email protected]

Laurent Dubuquoy

Pierre Desreumaux

4 Maladies de L’Appareil Digestif et de la Nutrition, CHU Lille, F-59000 Lille, Franța

Monique Capron

Annie Standaert

Date asociate

Abstract

1. Introducere

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

Substanțele chimice și reactivii au fost achiziționați de la Sigma - Aldrich Chemical (St Quentin Fallavier, Franța), dacă nu se specifică altfel. Loturile de proteine P28GST au fost produse și purificate din cultura recombinantă Saccharomyces cerevisiae în condiții de bune practici de fabricație de către Eurogentec SA (Seraing, Belgia). P28GST a fost conservat liofilizat în NH4HCO3 10 mM și 6% lactoză. Acest preparat a fost resuspendat extemporan cu sau fără hidroxid de aluminiu 0,2%, un adjuvant compatibil cu utilizarea animală și umană (Alhydrogel®, Brenntag Nordig, Frederikssund, Danemarca și Miltenyi Biotec, Paris, Franța).

2.2. Experimente pe animale și declarații de etică

Șoarecii BALB/c (femele, cu vârsta de 6 săptămâni) au fost achiziționați de la Charles Rivers (L’Arbresle, Franța) și au fost întreținuți în instalații de exploatare a animalelor fără patogeni. Experimentele pe animale s-au conformat legislației franceze (Legea Guvernului 87-848). Toate studiile au fost aprobate de comisia locală de revizuire a eticii investigaționale (Nord-Pas-de-Calais CEEA nr. 75, Lille, Franța; numerele de referință ale protocolului 352012 și 19-2009R) și acordul guvernului francez nr. APAFIS # 7542-20 1608251651940 ).

2.3. Protocoale de imunizare

Imunizarea a fost efectuată la șoareci BALB/c prin trei injecții subcutanate (pe spate între omoplați) de P28GST la 5 µg.kg -1 cu un interval de 2 săptămâni, așa cum s-a descris anterior [7]. Alternativ, șoarecii de control au primit fie soluție salină (CTL), adjuvant singur (adjuvant), fie P28GST cu adjuvant (P28GST + adjuvant).

2.4. Inducerea colitei acidului trinitrobenzen sulfonic (TNBS) și a scorului inflamației

Modelul acidului trinitrobenzen sulfonic (TNBS) al colitei acute induse chimic a fost implementat la femele BALB/c de 13 săptămâni (n = 10 șoareci per grup), așa cum s-a descris anterior [30]. Patologia anatomică și citirile inflamatorii, inclusiv reacția în lanț cantitativă a transcriptazei polimerazei au fost raportate în altă parte [31]. Pe scurt, 0,5 cm de probe mediane de colon au fost omogenizate folosind instrumentul FastPrep (MP Biomedicals, Illkirch, Franța), ARN-ul total a fost izolat folosind coloane RNAspin (Macherey-Nagel, Hoerdt, Franța). Transcrierea inversă și PCR în timp real au fost efectuate cu kituri de reacție (trusa de înaltă capacitate cDNA RT, Applied Biosystems - Fischer Scientific, Illkirch, Franța) și reactivi (Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems - Fischer Scientific, Illkirch, Franța), conform instrucțiunilor producătorilor. Reacțiile în lanț ale polimerazei (PCR) au fost efectuate cu o mașină MX3005P (Agilent Technologies, Les Ulis, Franța). O analiză de expresie a genei personalizată (TaqMan, Applied Biosystems) a fost utilizată cu primeri proiectați comercial și validați, care sunt enumerați în Tabelul S1 din Materialele Suplimentare. Gena de menaj, beta-actina, a fost administrată ca un control intern. Datele au fost analizate folosind metoda 2 - ΔΔCt și exprimate ca o creștere a valorilor grupului de control.

2.5. Pacienți și probe de fecale umane

Pacienții cu boală Crohn (CD) au făcut parte dintr-un studiu clinic pilot de fază 2a conceput pentru a evalua siguranța P28GST, având ca scop controlul inflamației în CD moderată (ClinicalTrials.gov,> NCT02281916). Atât Autoritatea franceză de sănătate (Agenția Națională de Securitate a Medicamentelor, ANSM), cât și Comitetul de Etică al Nord-Ouest IV au aprobat studiul pilot (numărul EudraCT 2013-000595-15), precum și toți subiecții și-au dat consimțământul informat pentru a participa la proces. Opt pacienți au fost incluși după intervenția chirurgicală de rezecție intestinală sau în CD moderat. Pacienții înrolați au primit trei injecții subcutanate (o injecție pe lună) de 100 µg de P28GST asociate cu Alhydrogel® ca adjuvant recomandat. Pentru acest studiu, probele fecale înainte și după administrarea P28GST au fost obținute numai pentru 5 pacienți și au permis analiza microbiotei. Probele au fost congelate și depozitate la -80 ° C până la analiză.

2.6. Analiza microbiotei

Extracția ADN-ului, analiza metagenomică vizată 16S și analizele bioinformatice au fost realizate în conformitate cu metodologiile optimizate și standardizate dezvoltate de Genoscreen (Lille, Franța) și sunt complet detaliate în materialele suplimentare.

2.7. Tratament antibiotic și transplant de microbiote fecale

În unele experimente, șoarecii naivi cu vârste potrivite (n = 20) au fost tratați cu antibiotice cu spectru larg timp de 5 zile pentru a facilita reconstituirea ulterioară a transplantului de microbiote fecale (Abx) (Figura S4). Compoziția de cocktailuri antibiotice și procedurile conexe sunt furnizate în materialele suplimentare.

Probele fecale de zece șoareci donatori (200 până la 300 mg fiecare) au fost colectate aseptic și adunate în 0,5% cisteină 1X PBS pentru a maximiza conservarea bacteriilor anaerobe. Scaunele (100 mg.mL -1) de la donatorii martori sau imunizați au fost resuspendate prin amestec viguros timp de 1 min și centrifugate la 2000 rpm timp de 2 min pentru a depozita resturile. Supernatantul a fost colectat și livrat șoarecilor primiți în funcție de vârstă prin gavaj oral (200 μL fiecare primitor) în termen de 15 minute de la excreție pentru a preveni modificările compoziției bacteriene. Șoarecii primiți (n = 10 fiecare grup), fie hrăniți cu dietă normală și apă potabilă, fie tratați cu antibiotice au fost supuși transplantului de microbiotă trei zile consecutive pe săptămână timp de trei săptămâni, de la prima creștere a imunizării P28GST (vezi și Figura S4).

2.8. Analize statistice

În cele din urmă, aceste observații au fost în concordanță cu semnăturile transcripționale din colonele inflamate (Figura 2 A - H). Într-adevăr, reglarea ascendentă indusă de TNBS a genelor inflamatorii (cum ar fi Il-6, Il-1β și Tnf-α legate de imunitate) și genele legate de stresul oxidativ (precum Nos2 și Cox2) a fost semnificativ mai puțin marcată de P28GST + Tratament adjuvant. Acesta din urmă a normalizat, de asemenea, scăderea genelor homeostatice care au fost reglate în jos în colită (cum ar fi Pparγ și Zo1).