Constituirea unei hărți genetice a rils derivate din grâu (T
Abstract
Principalele scopuri ale studiului au fost i) dezvoltarea unei prime populații de cartografiere a grâului de pâine cultivat în Kazahstan, ii) construirea hărții sale genetice pentru identificarea ulterioară a genelor asociate cu trăsături agronomice importante.
Din câte știm, aceasta este prima populație segregatoare și o hartă genetică dezvoltată pentru grâul de pâine kazah. Lucrarea este un exemplu al modului în care programele de creștere a plantelor din Kazahstan au început cu succes implementarea metodelor de creștere a plantelor de generația următoare.
Tehnologia KASP (Compatative Allele Specific PCR) a grupului LGC și a markerilor ADN SNP au fost exploatate pentru a genotipa și a construi o hartă genetică a populației segregatoare. Lungimea totală a hărții a fost de 1376 cM. Un total de 157 din cei 178 de markeri SNP folosiți inițiali au format 26 de grupuri de legături, lăsând 1 markeri duplicați și 20 de markeri neatribuiți. Distanța de prag între markeri a fost stabilită ≤ 30 cM. Prin urmare, s-au obținut două grupuri de legătură pentru cromozomi precum 2A, 2B, 2D, 3A, 5A, 6B și 7A. În ciuda unui marker duplicat și 20 de neatribuiți, cei 157 de markeri KASP SNP care au fost mapați acopereau genomurile A, B și D ale grâului. Funcția de mapare Kosambi a fost utilizată pentru a calcula unitățile de recombinare între producători. RIL-urile au fost dezvoltate prin metoda SSD până la generația F4. Aproape 97% din alelele identificate au fost utile în evaluarea diversității genetice a populației; restul de 3% nu au prezentat niciun rezultat. Ca rezultat, 77 de markeri ADN au fost mapați pentru A, 74 pentru B și 27 pentru genomii D. Populația de cartografiere va fi genotipată folosind un plan de matrice de densitate mare a markerului, cum ar fi Illumina iSelect, pentru a obține o hartă genetică cu o acoperire relativ mare. Apoi, populația și harta genetică de înaltă rezoluție vor fi utilizate pentru a identifica genele care influențează adaptarea grâului în Kazahstan.
Introducere
Grâul este o cultură de cereale. În ciuda faptului că există multe teorii ușor diferite despre originea sa, Semiluna Fertilă este considerată în principal a fi locul în care grâul a provenit și a fost domesticit (CW 1995) (Nesbitt și Samuel 1998) (Gustafson, Raskina și colab. 2009 ).). Cele trei genomi (AABBDD) de grâu hexaploid (Triticum aestivum L. ssp. Aestevium) derivate din diploid (DD) Aegilops tauschii și tetraploid (BBAA) sălbatic (Triticum turgidum L. (Tell), ssp. Dicoccoides) care la rândul său au moștenit genomul său AA de la Triticum urartu diploid și BB fie de la Aegilops speltoides diploide, fie de la alte specii dispărute (Wang, Luo și colab. 2013) (Feldman, Liu și colab. 1997). De la cultivarea pâinii, grâul a fost o cultură de mare importanță, care furnizează în prezent 20% din caloriile populației mondiale (Bushuk 1997). Prin urmare, grâul de pâine hexaploid (2n = 6x = 42) cu cel mai complex genom și originea istoriei este o cultură vitală pentru hrană și furaje din lume. Importanța sa este deosebit de ridicată în Kazahstan, deoarece i) majoritatea produselor alimentare locale constau din făină de grâu (Eken, Spanbayev și colab. 2016) ii) Kazahstanul este unul dintre cei trei mari exportatori mondiali de grâu, clasat în prezent ca unul dintre cele patru marii exportatori de grâu, care sunt cunoscuți în mod colectiv ca țările „coșului de pâine” din lume, împreună cu Ucraina și Rusia (Swinnen, Burkitbayeva și colab. 2017).
Materiale și metode
Dezvoltarea segregării/cartografierii populației
Extracția ADN-ului din RIL-urile Pam x Par și prepararea ADN-ului pentru genotipare utilizând KASP
Pentru a extrage ADN din liniile consangvinizate recombinate, cinci semințe din fiecare linie au fost semănate în cutii Petri și puse timp de 2 zile la 4 ° C pentru stratificare. După aceea, au fost transferați într-un incubator cu furii de temperatură de 27-30 ° C timp de 5-6 zile pentru germinare. Metodologia Dellaporta (Dellaporta, Wood și colab. 1983), cu modificări, a fost utilizată pentru a izola ADN-ul de răsaduri de grâu vechi de 5-6 zile. ADN-ul genomic extras a fost supus unei purificări ulterioare utilizând coloane de spin Qiagene Mini. Calitatea și cantitatea (A260/A280) de ADN extras au fost evaluate în spectrofotometru Nanodrop cu vizualizare suplimentară pe geluri de agaroză 1% pentru a evalua integritatea. ADN-ul fiecărui RIL a fost standardizat la o concentrație de 10 ng/μl pentru genotipare utilizând platforma KASP. Principala prioritate a platformei de genotipare KASP față de sistemele vechi este aceea că nu necesită mult timp pentru vizualizarea produsului PCR. Prin urmare, a atenuat enorm o metodă veche de vizualizare care consuma mult timp, electroforeza pe bază de gel, care utilizează substanțe chimice umede mutagene, cum ar fi bromura de etidiu. În plus, folosind tehnologia KASP pot fi detectate și inserții, ștergeri și modificări unice ale bazei (o nucleotidă) în genomi, ceea ce îl face un instrument puternic pentru a înlocui vechea metodă plictisitoare.
Construcția hărții genetice
Inițial, mai mult de trei sute de markeri ADN SNP proiectați de Universitatea Bristol (informațiile despre markerii ADN pot fi obținuți aici www.cerealsdb.uk.net (Wilkinson, Winfield și colab. 2012)) au fost folosiți pentru genotipul Pamyati Azieva și Paragon. Acest lucru indiferent dacă acei markeri moleculari au fost sau nu polimorfi. Odată ce au fost identificați markeri polimorfi care distingeu părinții genetic, aceștia au fost folosiți pentru a genotipa populația RIL. Pentru a construi harta de legătură genetică a RIL-urilor, software-ul MapDisto a fost utilizat inițial (http://mapdisto.free.fr/) (Heffelfinger, Fragoso și colab. 2017). Cu toate acestea, distanța hărții genetice a fost re-estimată utilizând un mediu software omnibus R. Motivul este că R este un instrument flexibil pentru a efectua calcule statistice pentru setul de date pentru a îmbunătăți calitatea hărții genetice. În ambele cazuri, funcția de mapare Kosambi (Kosambi 2016) a fost utilizată pentru a calcula fracțiile de recombinare și apoi pentru a converti unitățile în centiMorgans. Logaritmul cotelor (scor LOD) nu a fost mai mic de trei. În total, 72 de markeri moleculari SNP au fost mapați pentru A, 67 pentru B și doar 19 pentru genomii D, arătând importanța dezvoltării mai multor markeri polimorfi pentru genomul D pentru a-și desfășura potențialul genetic pentru analiza asocierii marker-trăsături. Nu au fost mapate markeri pentru cromozomii 3D și 4D ai grâului (Tabelul 1).