Consecințele metabolice ale cistinuriei BMC Nefrologie Text integral
Abstract
fundal
Cistinuria este o tulburare moștenită a transportului renal de aminoacizi care provoacă nefrolitiază recurentă și morbiditate semnificativă la om. Are o incidență de 1 din 7000 la nivel mondial, făcându-l una dintre cele mai frecvente tulburări genetice la om. Am caracterizat fenotipic un model de șoarece de cistinurie de tip A rezultat din eliminarea Slc3a1.
Metode
Knockout de Slc3a1 la nivelurile de ARN și proteine a fost evaluat utilizând PCR cantitativă în timp real și imunofluorescență. Slc3a1 șoarecii knockout au fost plasați pe diete normale sau de crescător și au fost evaluați pentru formarea de pietre de cistină în timp, urmărind analiza cu raze X și dezvoltarea leziunilor renale prin măsurarea biomarkerilor de leziuni. Leziunea renală a fost, de asemenea, evaluată prin analize histologice. Nivelurile de aminoacizi au fost măsurate în sângele șoarecilor folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță. Nivelurile de glutation hepatic au fost măsurate folosind un test pe bază de luminiscență.
Rezultate
Am confirmat eliminarea meciului Slc3a1 la nivel de ARN, în timp ce Slc7a9 ARN reprezentând co-transportorul a fost păstrat. După cum era de așteptat, am observat formarea pietrei vezicii urinare în Slc3a1 -/- șoareci. Masculin Slc3a1 -/- șoarecii au prezentat greutăți mai mici comparativ cu Slc3a1 +/+ . Slc3a1 -/- șoarecii care au urmat o dietă regulată au demonstrat creșterea azotului ureic din sânge (BUN) fără creșterea creatininei serice. Cu toate acestea, plasarea animalelor knockout pe o dietă de crescător, care conține o concentrație mai mare de cistină, a dus la dezvoltarea creșterii atât a BUN cât și a creatininei, care indică o boală cronică renală mai severă. Examenul histologic a arătat că aceste efecte dietetice au condus la agravarea obstrucției tubulare a rinichilor și a inflamației interstițiale, precum și la agravarea inflamației vezicii urinare. Cistina este un precursor al moleculei antioxidante glutation, deci am evaluat nivelurile de glutation în ficatul Slc3a1 -/- șoareci. Am găsit niveluri semnificativ reduse atât de glutation, cât și de glutation total la animalele eliminate.
Concluzii
Rezultatele noastre sugerează că dieta poate afecta dezvoltarea și progresia bolii renale cronice la un model animal de cistinurie, care poate avea implicații importante pentru pacienții cu această boală. În plus, glutationul redus îi poate predispune pe cei cu cistinurie la leziuni cauzate de stresul oxidativ.
fundal
Au fost generate modele de șoarece de cistinurie de tip I. Peters și colab. a identificat o mutație cu sens greșit Slc3a1 într-un ecran de mutageneză N-etil-N-nitrozourea (ENU) la șoareci C3HeB/FeJ [8]. Autorii au demonstrat o greutate redusă a rinichilor la bărbații homozigoti în comparație cu bărbații de tip sălbatic și femelele homozigote. În plus, nivelurile de uree plasmatică au fost crescute la bărbații homozigoti de la 13 la 20 de săptămâni în comparație cu animalele de tip sălbatic. Livrozet și colab. a identificat o mutație spontană în Slc3a1 la șoarecii 129SvPasCrl rezultând cistinurie [9]. Funcția renală nu a fost afectată semnificativ la șoarecii mutanți, măsurată prin măsurători ale creatininei serice. Cu toate acestea, au observat macrofage crescute și fibroză interstițială la șoarecii mutanți. Ercolani și colab. a demonstrat obstrucție la ieșirea vezicii urinare la șoareci masculi de cistinurie pe un backround mixt C57Bl/6 și 129/SvJ [10]. A fost raportată strategia genetică pentru generarea acestei linii de șoarece cistinurie [11]; cu toate acestea, am căutat să caracterizăm mai complet această tulpină de șoarece de cistinurie.
Metode
Animale
Slc3a1 -/- și șoareci de tip sălbatic (mascul și femelă) au fost crescuți și întreținuți așa cum s-a descris anterior și conform Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Nashville Tennessee Valley Healthcare System VA și Vanderbilt University Medical Center [10, 11]. Dietele normale și de crescător au fost obținute din Lab Diet (St. Louis, MO), cu 5L0D corespunzător normalului și 5LJ5 crescătorului. Șoarecii au fost adăpostiți la Nashville Tennessee Valley Healthcare System VA. Măsurătorile de greutate și lungime au fost efectuate pe șoareci care au fost crescuți și întreținuți pe chow de crescător. Pentru a măsura lungimea, șoarecii au fost anesteziați cu izofluran și măsurați de la vârful nasului până la vârful cozii. Animalele au fost repartizate aleatoriu în grupuri experimentale. La finalizarea studiului, animalele au fost eutanasiate în conformitate cu Asociația Medicală Veterinară Americană prin gaz CO2 urmat de luxația colului uterin.
PCR în timp real
Țesuturile șoarecilor au fost îndepărtate și imersate în ARNlater (Qiagen, Valancia, CA) pentru studii de expresie a ARNm. ARN-ul a fost extras folosind un kit Qiagen RNeasy. Perechile Primer au fost proiectate folosind software-ul Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) și expresia GAPDH a fost utilizată ca control endogen. Nivelurile de expresie ale ARNm ale Slc3a1 și Slc7a9 au fost evaluate prin PCR cantitativă în timp real folosind SYBR verde și un sistem de detectare a secvenței ABI 7900HT (Applied Biosystems). Grundele sunt enumerate în Tabelul 1.
Western blot, imunocolorare și histologie
Au fost preparate extracte de proteine din celule întregi
Imagistica cu raze X
Imaginea prezentată este a unui bărbat de paisprezece săptămâni Slc3a1 -/- șoareci. Pentru a monitoriza formarea pietrei de-a lungul timpului, șoarecii au fost duși la Institutul de Științe Imagistice al Universității Vanderbilt, anesteziați cu izoflouran și oxigen până la imobilizare, apoi au fost plasați într-un aparat cu raze X Faxitron 2000 la setarea 35 pentru un timp de expunere de 4 s.
Măsurători de biomarker și aminoacizi
Pentru măsurătorile BUN și creatinină, sângele a fost colectat într-un tub CB 300 Z microvetă cu activator al cheagurilor (Sarstedt, Newton, NC) prin sângerare submandibulară sub anestezie cu izofluran cu o lancetă de 5,5 mm. Probele au fost coagulate la temperatura camerei timp de> 30 min și centrifugate la 4500 rpm timp de 10-20 min. Serul a fost imediat alicotat și depozitat la - 80 ° C pentru măsurarea azotului uree din sânge de către Laboratorul de patologie comparată al Centrului Medical Vanderbilt University și măsurarea creatininei de către Laboratorul de biomarkeri Core C al Universității Alabama-Birmingham O'Brien Center Core C DOMNIȘOARĂ. Concentrațiile plasmatice de aminoacizi au fost determinate prin HPLC cu fază inversă utilizând o versiune modificată a metodelor Bidlingmeyer și colab. [23].
Măsurători ale glutationului
Nivelurile de glutation au fost măsurate utilizând un test GSH-GLO Glutathione Assay (Promega, Madison, WI) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrația proteică a lizatelor hepatice a fost determinată de BCA și concentrațiile normalizate la 400 ng/μl. Lizatele hepatice au fost testate +/− 500 μM TCEP. TCEP reduce orice glutation oxidat prezent în probă. Luminiscența a fost măsurată folosind un cititor de microplăci FLUOStar-Omega.
Rezultate
Am confirmat mai întâi eliminarea meciului Slc3a1 folosind RT-PCR pentru a evalua nivelurile de expresie în diferite țesuturi. Cum era de așteptat, Slc3a1 Nivelurile de ARN au fost reduse dramatic în țesuturile în care apare expresia în mod normal, cum ar fi rinichiul și intestinul subțire (Fig. 1a). În plus, așa cum era de așteptat, Slc7a9 Nivelurile de ARN au fost nealterate prin eliminarea Slc3a1 (Fig. 1b). Am folosit apoi Western blot și microscopie imunofluorescentă pentru a evalua pierderea expresiei rBAT în rinichi de Slc3a1 -/- șoareci. Western blot a demonstrat pierderea expresiei rBAT din lizatele renale (Fig. 1c). Microscopia imunofluorescentă pentru rBAT a demonstrat că eliminarea Slc3a1 a dus la pierderea expresiei rBAT în tubii proximali ai Slc3a1 -/- șoareci în comparație cu șoarecii de tip sălbatic (Fig. 1d și e).