Citrobacter freundii tirozin fenol-liază rolul asparaginei 185 în modularea funcției enzimei

M.V. Barbolina, R.S. Phillips, P.D. Gollnick, N.G. Faleev, TV Demidkina, Citrobacter freundii tirozin fenol-liază: rolul asparaginei 185 în modularea funcției enzimei prin stabilizarea unui intermediar chinonoid, Ingineria, proiectarea și selecția proteinelor, volumul 13, numărul 3, martie 2000, paginile 207-215, https: // doi.org/10.1093/protein/13.3.207

fenol-liază

Abstract

Introducere

Mecanismul general acceptat al catalizei TPL este prezentat în Schema 1.

Materiale și metode

Materiale

Lactatul dehidrogenază din mușchiul de iepure, piridoxal-P și NADH au fost achiziționate de la United States Biochemical (USB), la fel ca 1-tirozină, S-benzil-1-cisteină și S-etil-1-cisteină. De la Sigma s-au obținut β-clor-1-alanină, 1-fenilalanină, 1-metionină, acid 1-aspartic și 1-homoserină. S-metil-1-cisteina a fost un produs al ICN Biochemical. S- (o-nitrofenil) -1-cisteina (SOPC) a fost preparată așa cum s-a descris anterior (Phillips și colab., 1989). 3-Fluoro-1-tirozina a fost preparată prin sinteză enzimatică (Phillips și colab., 1990). [α- 2 H] -3-Fluoro-1-tirozină a fost realizată prin efectuarea sintezei enzimatice în 2 H2O așa cum a fost descris anterior pentru l-tirozină (Kilk și Phillips, 1988). [α, β, β- 2 H3] -3-Fluoro-1-tirozină a fost preparată așa cum a fost descris de Faleev și colab. (1996).

Pregătirea N185A TPL

Mutageneza specifică site-ului direcționată de oligonucleotide a fost realizată cu utilizarea plasmidei pTZTPL, care conține gena tpl de la C.freundii în pTZ18U (US Biochemical) (Antson și colab., 1993). ADN monocatenar a fost preparat cu ajutorul fagului auxiliar M13K07 (Vieira și Messing, 1987). Mutageneza dirijată la locul de desfășurare a fost efectuată prin metoda lui Taylor și colab. (1985) folosind trusa de mutageneză Sculptor in vitro de la Amersham. Pentru a efectua înlocuirea necesară Asn185 - Ala s-a pregătit oligonucleotida mutagenetică 5'-AGTCACGGTTGCCCTCGCAGGCGG-3. Plasmidele rezultate au fost examinate prin secvențierea dideoxi (Sanger și colab., 1977) în regiunea de mutație folosind Sequenază (US Biochemical.) Și un primer complementar nucleotidelor 1050-1073 din secvența genică tpl definită de Antson și colab. (1993). Plasmida care poartă schimbarea N185A a fost desemnată pTZTPL N185A. Celulele Escherichia coli SVS370 au fost utilizate ca gazdă pentru plasmidă. Celulele au fost crescute și enzima a fost purificată așa cum s-a descris anterior (Chen și colab., 1995b). TPL de tip sălbatic a fost purificat din celule E.coli SVS370 care conțin plasmida pTZTPL prin același procedeu.

Analize enzimatice

Activitatea enzimatică a fost măsurată în mod obișnuit cu S- (o-nitrofenil) -1-cisteină 0,6 mM (SOPC) în fosfat de potasiu 50 mM, pH 8,0, la 25 ° C (Phillips, 1987), urmând scăderea absorbției la 370 nm = ε = –1,86 × 10 3 l/mol.cm). O unitate de activitate a fost determinată ca cantitate de enzimă care catalizează transformarea a 1 μmol de SOPC pe minut.

Reacțiile de eliminare β au fost măsurate utilizând un test cuplat cu lactat dehidrogenază și NADH măsurat la 340 nm (Δε = –6,22 × 10 3 l/mol.cm), așa cum este descris de Morino și Snell (1970) pentru triptofanază. Amestecurile de reacție conțineau 50 mM fosfat de potasiu, pH 8,0, 50 μM piridoxal-P, 0,2 mM NADH, 0,02 mg lactat dehidrogenază și diferite cantități de substrat de aminoacizi într-un volum total de 0,6 ml, la 25 ° C. Reacția a fost inițiată prin adăugarea unei soluții de enzime. Determinarea parametrilor cinetici pentru SOPC a fost efectuată la 25 ° C în 50 mM fosfat de potasiu, pH 8,0, 5 mM 2-mercaptoetanol și 50 μM piridoxal-P, cu cantități variabile de SOPC și diluții adecvate de tip sălbatic și mutant TPL.

Efectele inhibitoare ale aminoacizilor asupra TPL mutant au fost determinate folosind SOPC ca substrat așa cum s-a descris mai sus.

Determinarea proteinelor

Proteina a fost determinată prin metoda lui Lowry și colab. (1951), utilizând albumina serică bovină ca standard. Concentrația TPL purificată a fost determinată din absorbanța la 278 nm (E 1% = 8,37) (Muro și colab., 1978), presupunând o masă moleculară subunitară de 51,4 kDa (Antson și colab., 1993).

Experimente de schimb de izotopi

Reacțiile de schimb de izotopi cu l-fenilalanină și l-metionină au fost efectuate în tampon fosfat de potasiu 50 mM în prezența piridoxal-P 0,1 mM într-un volum total de 4 ml. PH-ul soluției măsurat potențiometric cu un electrod de sticlă a fost egal cu 8,2, ceea ce corespunde p 2 H = 8,6 (Blesoe și Long, 1960). Concentrația de l-fenilalanină a fost de 28,6 mM, s-au adăugat 6,7 mg de [N185A] TPL și s-au retras alicote din amestecul de reacție după 1, 2, 3, 5 și 7 ore și s-au încălzit la 90 ° C timp de 5 minute pentru a opri reacție și apoi analizate prin 1H RMN. În reacția cu 1-metionină, concentrația acestuia din urmă a fost de 132 mM, s-au adăugat 3,34 mg de [N185A] TPL și s-au retras alicote după 5, 8, 26, 35 și 51 ore și s-au tratat ca mai sus. Raportul dintre produsele deuterate și nedeuterate a fost calculat din intensitățile relative relative ale semnalelor grupului α-proton și β-CH2, acesta din urmă fiind utilizat ca standard intern.

Măsurători ale debitului oprit

Înainte de efectuarea experimentelor cinetice rapide, enzima mamă a fost incubată cu piridoxal-P 1 mM timp de 1 oră la 30 ° C la pH 7,0 și apoi separată de piridoxal-P în exces folosind o coloană scurtă de desalinizare (PD-10, Pharmacia) echilibrată cu S-a măsurat 50 mM fosfat de potasiu, pH 8,6 și activitatea preparatului. Nu a fost observată nicio pierdere de activitate. Datele cinetice cu flux oprit de scanare rapidă au fost obținute cu un instrument RSM de la OLIS. Acest instrument are un timp mort de

2 ms și este capabil să colecteze spectre în regiunea vizibilă de la 300 la 600 nm la 1 kHz. Soluțiile enzimatice în fosfat de potasiu 50 mM, pH 8,6, au fost amestecate cu diferite concentrații de aminoacizi și s-au urmat modificări de absorbanță la 500 nm. Constantele de viteză au fost evaluate prin ajustarea exponențială utilizând programele LMFT sau SIFIT furnizate de OLIS. Validitatea montajului a fost evaluată prin deviația standard sau prin parametrul Durbin - Watson. De obicei, constantele de rată au fost estimate la o deviație standard de (Strickland și colab., 1975), folosind Enzfitter (Elsievier), unde kf și kr sunt constantele de rată înainte și inversă, respectiv.

unde Kp este afinitatea enzimei pentru produsul deuterat și [S] 0 este concentrația inițială a substratului.