Celulele fără text integral mTORC2 sunt implicate în inducerea fosforilării RSK de către ser sau

Fosforilarea RSK la locul motivului hidrofob este diminuată în celulele perturbate mTORC2. (A) RSK are două domenii catalitice conservate, domeniile kinazei N-Terminal (NTKD) și C-Terminal (CTKD) care sunt fosforilate la fiecare dintre buclele lor de activare (T-Loop). Aceste două domenii flancează o regiune linker care este conservată printre kinazele AGC care conțin turnul conservat (TM) și motivele hidrofobe (HM) care devin fosforilate la siturile indicate. (B) MEF de tip sălbatic (WT) sau SIN1 -/- au fost crescute în DMEM complet (bazal; B) sau crescute apoi înfometate cu ser peste noapte. Serul a fost adăugat din nou și celulele au fost incubate timpii indicați (min) înainte de recoltare. Lizatele totale au fost preparate cu CHAPS conținând tampon și supuse SDS-PAGE și imunoblotare folosind anticorpi indicați. (C) Celulele HeLa au fost transfectate cu control scramble (scr) sau siRNA care vizează mTOR. Celulele au fost lizate folosind RIPA și procesate ca în B. (D) Timocitele cu ștergere de tip sălbatic (+/+), heterozigoți (+/−) sau homozigote (-/-) de rictor au fost lizate și supuse SDS-PAGE și imunoblotării. (E) Timocitele de tip sălbatic (WT) sau cu deficit de rictor nu au fost stimulate (0) sau stimulate cu anticorp CD3ε (10 μg/ml) pentru timpii indicați (min).

integral

Activarea ERK este esențială, dar nu suficientă pentru fosforilarea completă a sitului RSK HM. (A) Celulele HeLa au fost resuspendate în mediu complet fără ser, în prezența sau absența U2016 15 μM pentru timpii indicați. S-a adăugat 1 × FBS (ser) după cum s-a indicat, în ultimele 0,5 ore înainte de recoltare. Celulele au fost recoltate în tampon de liză CHAPS și extractele de proteine ​​au fost supuse SDS-PAGE și imunoblotare folosind anticorpi indicați. (B) MEF de tip sălbatic (WT) sau SIN1 -/- au fost crescute în DMEM complet (bazal; B) sau crescute apoi înfometate cu ser peste noapte. Serul a fost adăugat din nou și celulele au fost incubate timpii indicați (min). Celulele au fost recoltate și prelucrate ca în (A). (C) MEF WT sau SIN1 -/- au fost crescute peste noapte în absența serului, urmate de adăugarea de ser sau PMA pentru perioadele indicate. (D) WT sau rictor -/- timocitele nu au fost stimulate (0) sau stimulate cu Anti-CD3 și 10 ng/ml PMA pentru timpii indicați (min).

Fosforilarea sitului RSK HM este crescută în timpul retragerii nutrienților. (ANUNȚ). Creșterea HeLa (A - C) sau WT MEF (D) au fost resuspendate în medii cu sau fără FX dializat 1X (dFBS) sau 1 × dFBS așa cum se indică în (C, D) și lipsit (-) sau conținând (+) fie glucoză (A), glutamina (B) sau atât glucoza cât și glutamina (C, D) la momentele indicate. În (C, D), celulele au fost recoltate după 1 oră. Celulele au fost lizate cu tampon RIPA și procesate pentru SDS-PAGE și imunoblotare. (E) Celulele în creștere au fost resuspendate în mediu cu dFBS în absența sau prezența glucozei și/sau 500 μM 2-Deoxiglucoză (2DG) și incubate pentru perioadele indicate. (F) WT în creștere sau SIN1 -/- MEF au fost resuspendat în medii lipsite sau conținând glucoză, glutamină și/sau dFBS și incubat timp de 1 oră înainte de recoltare. Celulele au fost recoltate și procesate pentru SDS-PAGE și imunoblotare.