Caracterizarea speciilor de bacil utilizate pentru bacterioterapia orală și bacterioprofilaxia

ABSTRACT

Sporii Bacillus subtilis sunt folosiți pentru bacterioterapia orală și bacteriofilaxia tulburărilor gastrointestinale atât la oameni, cât și la animale. Deoarece B. subtilis este un saprofit aerob, modul în care sporii pot beneficia microbiota intestinală este o întrebare interesantă, deoarece alte probiotice, cum ar fi Lactobacillus spp. care colonizează intestinul sunt anerobi. Ca prim pas în înțelegerea efectelor potențiale ale ingerării de spori, am caracterizat cinci produse comerciale. O analiză biochimică, fiziologică și filogenetică extinsă a relevat că patru dintre aceste produse sunt etichetate greșit. Mai mult, patru dintre aceste produse au prezentat niveluri ridicate de rezistență la antibiotice.

caracterizarea

Probioticele sau „bacteriile prietenoase” devin din ce în ce mai accesibile publicului ca alimente funcționale benefice care pretind să promoveze beneficii specifice pentru sănătate pentru consumatori (2, 14, 18). În unele țări, probioticele sunt disponibile pentru bacterioterapie orală și bacterioprofilaxie a tulburărilor gastrointestinale la om. De multe ori aceste tulburări, dintre care multe duc la diaree, sunt rezultatul direct al utilizării antibioticelor, care produce un dezechilibru în compoziția florei microbiene intestinale normale. În industria zootehnică, utilizarea probioticelor are potențial ca alternativă la antibiotice prin excluderea competitivă a microorganismelor patogene (19), unele produse comerciale, cum ar fi Paciflor, sunt deja disponibile. Cele mai frecvent utilizate bacterii ca probiotice includ bacteriile lactice (de exemplu, lactobacili, enterococi, streptococi și bifidobacterii). Dovezile experimentale sugerează acum că ingestia unui număr substanțial de bacterii dăunătoare oferă într-adevăr un efect benefic florei enterice (18). Tocmai modul în care se realizează acest lucru și dacă revendicările comerciale sunt justificate rămâne o problemă controversată, deși (14).

Pe lângă bacteriile lactice, speciile de Bacillus sunt vândute și ca probiotice. Acestea constau din preparate de spori bacterieni, cu potențialul avantaj că sporii pot supraviețui tranzitului prin stomac intacte. Speciile de Bacillus sunt substanțial diferite de alte bacterii probiotice, totuși, fiind în primul rând saprofite aerobe găsite în sol. Dacă într-adevăr au beneficii pentru sănătate, atunci o întrebare evident importantă este cum? Sporii germinează și colonizează intestinul, exclud competitiv colonizarea prin potențiali agenți patogeni sau sporul latent oferă un stimul unic microbiotei intestinale, cum ar fi imunitatea locală îmbunătățită?

Într-un studiu anterior am arătat că un probiotic major de bacil comercializat în Europa conținea spori ai unei specii de Bacillus fără legătură taxonomică și filogenetică (4). Acest lucru a fost surprinzător, având în vedere că în Europa probioticele trebuie să fie autorizate pentru a fi utilizate ca aliment funcțional sau nou.

În această lucrare am examinat și caracterizat cinci probiotice din sporul Bacillus comercial ca un prim pas în înțelegerea naturii probioticelor din spori.

MATERIALE ȘI METODE

Tulpini bacteriene. Bacteriile au fost recuperate prin suspendarea preparatelor probiotice uscate în apă distilată, urmate de diluare și placare în serie pe agar de sporulare Difco (11). Preparatele comerciale și producătorii au fost după cum urmează: Lactipanplus (Istituto Biochimico Italiano S.p.A., Milano, Italia), Domuvar (Consorzio Farmaceutico e Biotecnologico Bioprogress a.r.i., Anagni-FR, Italia), Bactisubtil Marion Merrell S.A. Bourgoin-Jallieu, Franța), Biosubtyl, (Institutul Național de Vaccinuri și Substanțe Biologice, Da Lat, Vietnam) și Subtyl (Fabrica Farmaceutică 24, Ho Chi Minh City, Vietnam). Ca aB s-a folosit un Bacillus subtilisstrain validat, PY79 (20), un derivat al tulpinii 168. tulpina de tip subtilis.

Depuneri de tulpini. Toate tulpinile caracterizate în această lucrare au fost depuse la Bacillus Genetic Stock Center (BGSC), Ohio State University, Columbus (http://bacillus.biosci.ohio-state.edu/). (Numele desemnate de BGSC sunt date în tabelul 5.)

Teste biochimice. Kitul API 50 CH (BioMerieux), cuprinzând 49 de teste biochimice unice adecvate pentru Bacillus spp., A fost utilizat pentru diagnostic așa cum este descris în instrucțiunile producătorului. Testul complet a fost efectuat de cinci ori pentru fiecare tulpină. Hidroliza amidonului a fost așa cum s-a descris anterior (3). Creșterea la pH 10,1 a fost prin metoda lui Horikoshi și Teruhiko (7), folosind Na2CO3 pentru a ajusta pH-ul. Sporularea a fost indusă prin epuizarea nutrienților folosind mediu de sporulare Difco și măsurători ale sporilor rezistenți la căldură s-au făcut așa cum s-a descris anterior (11).

Microscopie electronică. Suspensiile de bacterii sporulante (din culturi de plăci vechi de 4 zile) au fost fixate în glutaraldehidă 3% plus 4% paraformaldehidă în 0,1, M PIPES [piperazină-N, N'-bis] (acid 2-etansulfonic) tampon (pH 7,2) conform metodei 1 din Page și colab. (12) Secțiunile de argint ale materialului încorporat în rășină Spurr au fost colorate cu acetat de uranil urmate de pata de plumb Reynolds și vizualizate pe un microscop electronic de transmisie Zeiss EM 109.

Testarea antibioticelor. Culturile de plăci proaspete cultivate pe mediu Luria-Bertani (LB) au fost folosite pentru a produce suspensii bacteriene cu o densitate de aproximativ 0,5, ajustate utilizând standardele McFarland. Plăcile Mueller-Hinton (Merck; standard NCCLS) au fost însămânțate folosind tampoane. Discurile impregnate cu antibiotice (diametru 6 mm; Oxoid) au fost plasate pe plăcile însămânțate și după 18 ore de creștere la 37 ° C, s-au măsurat zonele de inhibare. Acele tulpini care prezintă o zonă de inhibare cu diametrul mai mic de 12 mm au fost caracterizate în continuare pentru MIC a antibioticului necesar pentru a inhiba creșterea celulară. MIC-urile au fost determinate folosind culturi cultivate în bulion Mueller-Hinton.