Articolul complet Proteine ​​omoloage cu acvaporine ale plantelor superioare din alga de apă dulce Ulothrix

Articole originale

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Citații
  • Valori
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF
  • EPUB

Abstract

Introducere

Algele verzi filamentoase Ulothrix zonata (Weber et Mohr) Kütz. (Ulotrichales, Ulvophyceae) este o specie larg distribuită, care locuiește de obicei în zona de stropire și în apele puțin adânci ale lacurilor temperate. Specia pare a fi adaptată la frig și prezintă de obicei modele de creștere sezonieră (Graham și colab., 1985 ). În lacul Baikal, Zona U. se dezvoltă intens în martie - aprilie pe suprafața inferioară a stratului de gheață din Lacul Baikal la temperaturi relativ stabile apropiate de 0 ° С. Crește din abundență în perioada fără gheață (mai - septembrie) (Izhboldina, 1990) și în timpul verii formează o acoperire densă pe pietre la marginea apei, unde filamentele sunt expuse la fluctuații semnificative ale temperaturii diurne.

acvaporine

Publicat online:

Figurile 1-4. Modificări ale habitatului și dimensiunilor celulare ale Ulothrix zonata în diferite anotimpuri. Figurile 1, 2. Populația de gheață în martie. (Fig. 1) Suprafața de gheață acoperită de Zona U.. (Fig. 2) Filamente ușor pigmentate ale populației de gheață. Figurile 3, 4. Populația de alge bentice. (Fig. 3) Pietre acoperite de Zona U.. (Fig. 4) Celulă scurtă, dens pigmentată Zona U. filamente ale populației de vară. Barele la scară: Figurile 2 și 4, 100 µm.

Figurile 1-4. Modificări ale habitatului și dimensiunilor celulare ale Ulothrix zonata în diferite anotimpuri. Figurile 1, 2. Populația de gheață în martie. (Fig. 1) Suprafața de gheață acoperită de Zona U.. (Fig. 2) Filamente ușor pigmentate ale populației de gheață. Figurile 3, 4. Populația de alge bentice. (Fig. 3) Pietre acoperite de Zona U.. (Fig. 4) Celulă scurtă, dens pigmentată Zona U. filamente ale populației de vară. Barele la scară: Figurile 2 și 4, 100 µm.

Aclimatizarea fiziologică și adaptarea algelor din comunitățile de gheață de apă dulce rămân insuficient studiate. Anterior, gheața și populațiile bentice de Zona U. de la lacul Baikal s-au dovedit a fi diferite de cele marine Ulothrix specii având un conținut ridicat de acizi grași polinesaturați (FA) și fluctuații sezoniere ale temperaturii apei au avut doar un efect negativ asupra cantității lor totale (Osipova și colab., 2009). Controlul activ al debitului de apă poate fi crucial pentru adaptarea la temperaturi scăzute, dar detaliile mecanismelor sunt necunoscute (Maurel și colab., 2008). Mișcarea apei peste membranele plasmatice și tonoplastice este mediată de acvaporine, cu diferiți membri ai acestei familii de gene specifice dezvoltării, stresului și distribuției celulare. În literatură, există o serie de date despre rolul important al acvaporinelor aparținând familiei PIP în adaptarea la temperaturi scăzute. Tratamentul la rece a reglementat în jos expresia majorității genelor PIP în Arabidopsis (Tineri și colab., 2004) și în frunzele de grâu, s-a observat o creștere mare a nivelurilor de transcriere PIP după aclimatizarea la rece (de la 22 ° C la 4 ° C) (Herman și colab., 2006).

În acest studiu, am fost interesați de detectarea acvaporinelor legate de proteinele intrinseci ale membranei plasmatice (PIP) din Zona U., Lacul Baikal și posibila variație sezonieră a abundenței lor.

Materiale și metode

Produse chimice

Ponceau S, Tween-20, DTT, nBT, BCIP și SigmaMarker (gamă largă 6500-200 000 Da) au fost achiziționate de la Sigma Inc. (St. Louis, Missouri). PMSF au fost obținute de la Calbiochem (SUA); PVP de la Biomedicals (Germania); membrane de nitroceluloză Hybond ECh de la Amersham Biosciences (Marea Britanie); anticorpi secundari conjugați cu fosfatază alcalină de la Promega (SUA). Antiserurile primare utilizate au fost anticorpii anti-AtTIP de la Agrisera, Suedia (produsul AS09 493) recunoscând o peptidă C-terminală γ-TIP (TIP1) INQNGHEQLPTTDY și anticorpi anti-ZmPIP1 de iepure direcționați împotriva unei peptide N-terminale conservate de ZmPIPA isoformăSQEGPEDKGGKK Ballesta și colab., 2008). Pentru controlul specificității, am folosit blocarea antiserurilor cu proteina recombinantă de fuziune GST-ZmPIP1-N-terminal, care a fost utilizată pentru creșterea anticorpilor, și TIP1; 1, TIP1; 2 (tonoplast proteină intrinsecă) care blochează peptida de la Agrisera (produsul AS09 493P), respectiv.

Materiale vegetale

Ulothrix zonata a fost prelevat de la suprafața inferioară a stratului de gheață (0,9-1 m grosime) al lacului Baikal în martie și aprilie 2006 prin scufundări și din pietre la marginea apei în iulie 2006, iulie și octombrie 2007 și în 10 și 19 octombrie 2013 Toate probele au fost eliminate de impurități vizibile și transportate la laborator într-un recipient termostabil în decurs de 1 oră. Probele au fost uscate pe hârtie de filtru (Bio-Rad) și apoi algele au fost congelate în N2 lichid și depozitate la -70 ° C până la extracție. Aproximativ 96% din eșantioanele sub gheață (martie și aprilie 2006), 95% din eșantioanele colectate în iulie 2006 și 2007 și 97-99% din cele din octombrie 2007 și 2013 au fost compuse din Zona U. filamente cu o cantitate neglijabilă de diatomee epifite. Arabidopsis thaliana frunzele au fost utilizate ca un control pozitiv.

Măsurători ale dimensiunii celulei

S-au luat măsurători ale lungimii și lățimii a 50 de celule selectate din fiecare populație la întâmplare sub microscopul luminos „Peraval” (Carl Zeiss Jena, Germania) la o mărire de 800 ×. Pentru a estima volumul celulei (V) și suprafața (S), a fost aleasă cea mai apropiată figură geometrică (adică cilindru) și s-au efectuat calculele folosind formulele V = πr 2 l și S = 2πrl + 2πr 2, unde r este raza celula, iar l este lungimea celulei.

Monitorizarea temperaturii apei

Temperatura a fost înregistrată continuu la intervale de 1 oră la locurile de eșantionare cu senzori autonomi programabili (Stow Away TidBit Loggers, OnSet Corp., Cape Cod, Massachusetts), atât la marginea apei, cât și la o adâncime de 3,6 m. Temperatura apei la marginea apei a fost măsurată cu un termometru cu mercur la temperaturi negative ale aerului (de exemplu, în octombrie 2007).

Prepararea extractelor de proteine

Algele congelate au fost omogenizate cu nisip și tampon cu conținut ridicat de silice (pH 7,5), conținând 50 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 mM DTT, 0,1% PVP și 0,5 M zaharoză într-un raport 1: 1 (w/c) timp de 20 de minute. Omogenatul a fost sonicat (40 kHz timp de 20 de minute) și centrifugat la 10.000 g timp de 20 de minute, fracția de supernatant a fost centrifugată la 100.000 g timp de 1 oră într-o ultracentrifugă (Sorvall Discovery 90SE, SUA). Peleta rezultată (proteine ​​microsomale) a fost resuspendată în tampon Tris-HCI 5 mM (pH 7,5), conținând 0,33 M zaharoză și 2 mM DTT. O fracție microsomală a fost luată din frunzele de Arabidopsis și folosit pentru a controla analiza western blot. Toate procedurile au fost efectuate la 4 ° C. Conținutul de proteine ​​a fost determinat așa cum este descris de Bradford (1976), utilizând albumina serică ca standard de calibrare.

SDS-PAGE și analiza western blot

Extracția și secvențierea ADN-ului

Publicat online:

Tabelul 1. Lista de Ulothrix zonata exemplare din lacul Baikal și împrejurimi pentru care s-au determinat secvențe ITS2 și parțiale de ADNr LSU.

Rezultate

Temperaturile apei în habitatul Ulothrix zonata

Măsurătorile temperaturii apei pe țărm au arătat fluctuații diurne marcate: în iulie 2006, temperatura apei s-a schimbat de la 5,5ºС noaptea la 11ºС ziua; în iulie 2007 de la 5ºС noaptea la 15ºС ziua; în octombrie 2007, temperatura apei a scăzut la 6-8ºС, iar temperatura aerului nocturn a scăzut la -5ºС. În martie și aprilie 2006, temperatura apei sub gheață a variat între 0,1-0,3ºС și nu a variat semnificativ. Temperatura apei măsurată în 10 și 19 octombrie 2013 a fost de 6-7ºС și respectiv 4,3ºС.