Analogii timidinei suprimă autofagia și adipogeneza în agenții antimicrobieni adipocite cultivate
ABSTRACT
INTRODUCERE
Terapia antiretrovirală foarte activă (TARGA) a fost asociată cu dezvoltarea așa-numitului „sindrom lipodistrofic” (LD) (1-3). În cohorte cu utilizare predominantă a analogilor timidinei (TA), procentul pacienților seropozitivi diagnosticați ca lipodistrofici a atins nivelul de aproape 50% (1). Prevalența LD rămâne o problemă majoră în medicina HIV, având în vedere că analogii timidinei sunt încă foarte folosiți în țările cu resurse limitate (3, 4) și că lipoatrofia demonstrează doar o reversibilitate redusă după înlocuirea analogilor timidinei.
Pierderea periferică de grăsime ca parte a sindromului lipodistrofiei a fost legată în principal de utilizarea analogilor nucleozidici, în special a stavudinei (d4T) și a zidovudinei (AZT) (5, 6). Țesutul adipos abdominal subcutanat de la pacienții infectați cu HIV-1 cu lipoatrofie periferică a fost caracterizat printr-un nivel crescut de apoptoză (7, 8) și expresia afectată a markerilor adipogeni (9). Se presupune că perturbarea adipogenezei legată de medicament în combinație cu pierderea crescută a celulelor ar duce la atrofia țesutului adipos. Folosind linii celulare bine caracterizate și adipocite umane primare, noi și alții au confirmat în mod repetat proprietățile antiadipogene ale AZT și d4T in vitro (10-15), care ar putea avea un impact clinic asupra adipogenezei in vivo (16).
O serie de studii recente au sugerat un rol central al autofagiei adipocitelor în menținerea homeostaziei țesutului adipos (19-21). Inhibarea genetică și farmacologică a autofagiei adipocitelor a fost legată mecanic de scăderea masei adipoase și de afectarea adipogenezei (19-21).
Deoarece efectele in vivo și in vitro ale tratamentului AZT și d4T ale homeostaziei adipocitelor amintesc de o situație în care echilibrul autofagic este compromis, am emis ipoteza că unele dintre efectele antiadipogene ale acestor medicamente ar putea fi mediate prin impactul lor asupra autofagiei.
MATERIALE ȘI METODE
Inhibarea genetică a autofagiei a fost realizată prin eliminarea ATG5 (shATG5) mediată de ARN cu ac de păr (shRNA) (Santa Cruz). ATG5 codifică o proteină autofagică critică necesară pentru maturarea membranei autofagice (19). CopGFP și ARNs nespecific au fost utilizate ca martori conform instrucțiunilor producătorului (Santa Cruz). Transducția și eliminarea s-au efectuat prin utilizarea particulelor lentivirale cu până la cinci constructe de expresie distincte. Eficiența transducției determinată de numărul de celule GFP-pozitive după selecția puromicinei a depășit în general 95%.
Analiza efectelor inhibitorilor nucleozidici de transcriptază inversă (INRT) asupra activității autofagice celulare. O considerație esențială în analiza autofagiei celulare este faptul că autofagozomii corespund unei structuri intermediare a unui proces dinamic și că cantitatea lor totală la un anumit punct de timp este o funcție a două variabile: generație versus dispariție (18). Prin urmare, o creștere a prezenței autofagozomilor ar putea însemna fie inducerea, fie blocarea autofagiei tardive (la un pas în aval de formarea autofagozomilor [AF]). Măsurarea fluxului autofagic permite discriminarea între aceste două scenarii (18).
Analiza cu microscopie fluorescentă a efectului NRTI asupra formării autofagozomilor. GFP-LC3 a fost vizualizat utilizând microscopia convențională cu fluorescență în conformitate cu liniile directoare recent actualizate (18). Rezerva citoplasmatică GFP-LC3 a fost detectată ca un semnal dispersat omogen, în timp ce autofagozomii marcați GFP-LC3-II au fost vizualizați ca formațiuni de puncte (18). Formarea artefactelor experimentale ca rezultat al potențialelor agregate voluminoase GFP-LC3 a fost minimizată prin utilizarea celulelor transduse stabil în combinație cu selecția clonă adecvată (18).
Pentru experimente cu imagistica a celulelor vii, celulele 293T și 3T3-F442A care exprimă stabil GFP-LC3 au fost crescute pe lamele de sticlă. Celulele au fost supuse incubațiilor desemnate la 37 ° C în 5% CO2. Pentru fiecare condiție separată de tratament, au fost preluate imagini de fluorescență de la mai multe celule aparținând unui număr de câmpuri alese aleatoriu cu un filtru GFP folosind un instrument Olympus IX81 și analySIS (Soft Imaging System GmbH).
Analize citometrice în flux ale activității autofagice. Pentru a măsura fluxul autofagic, am profitat de un test citometric de flux recent dezvoltat pentru a monitoriza autofagia în celulele vii de mamifere (18). Această metodă cantitativă extrem de sensibilă se bazează pe monitorizarea cifrei de afaceri a markerului autofagosomal tradițional LC3 marcat cu GFP folosind citometrie de flux. Activarea și inhibarea activității autofagice sunt detectate corespunzător ca o scădere sau creștere dependentă de timp a semnalului total GFP celular (18). Activarea autofagiei intensifică livrarea GFP-LC3 în autolizozomi, ducând la degradarea și dispariția selectivă a semnalului GFP (18). Inhibarea autofagiei, pe de altă parte, are ca rezultat un blocaj al fluxului autofagic, ducând la acumularea GFP-LC3 și, prin urmare, la o creștere a semnalului fluorescent (18). Inhibarea autofagiei a fost, de asemenea, studiată prin măsurarea capacității NRTI de a inversa dispariția indusă de activator a semnalului de fluorescență GFP-LC3 (18).
Analiza citometrică de flux a activității autofagice a celulelor 293T și 3T3-F442A a fost măsurată, deoarece celulele subconfluente care exprimă stabil GFP-LC3 au fost incubate în condiții diferite. Celulele au fost tripsinizate, puse pe gheață și analizate folosind fie FACSCalibur, fie LSR II (Becton, Dickinson Biosciences) și datele numărului de celule reprezentate ca intensitate a fluorescenței GFP.
Colorarea lipidelor intracelulare. Pentru colorarea cu ulei roșu O (Sigma-Aldrich, München, Germania), celulele aderente 3T3-F442A au fost formaldehidă (10%) fixate, spălate și colorate cu o soluție de 0,21% (greutate/vol) roșu ulei O (60% izopropanol, 40% apă). Cuantificarea conținutului de triacilgliceride a fost efectuată după uscarea celulelor și extracția roșu de ulei O cu izopropanol 100% urmată de măsurare fotometrică la 495 nm.