Analogii acizilor grași cu lanț lung suprimă cercetarea tumorilor mamare și a cancerului de progresie

Abstract

Introducere

S-a raportat în mod repetat că dietele ketogenice cu restricție de carbohidrați, îmbogățite în grăsimi în detrimentul glucidelor, suprimă cancerul de sân (15, 16). Suprimarea tumorilor de către dietele ketogenice a fost atribuită limitării insulinei și IGF1 care acționează ca factori de creștere (revizuite în ref. 17) și cerinței obligatorii a celulelor maligne pentru metaboliții derivați din glucoză (de exemplu, nucleotide, NADPH) pentru aprovizionarea cu cerințele lor de biomasă. (Efectul Warburg, revizuit în ref. 18). Într-adevăr, cancerul de sân este promovat de rezistența la insulină/hiperinsulinemie, iar sensibilizatorii la insulină utilizați pentru tratarea diabetului de tip 2 (de exemplu, metformina) par a fi eficienți în suprimarea tumorigenezei în general și a cancerului de sân în special (19). Alternativ, eficacitatea dietelor ketogenice în suprimarea tumorigenezei poate fi atribuită în continuare eficacității inerente a acizilor grași cu lanț lung liber/neesterificat (LCFA), dacă li se permite să atingă concentrații intracelulare suficient de mari. Restricția carbohidraților poate permite într-adevăr acest lucru, limitând disponibilitatea glicerol-3-fosfatului și insulinei necesare pentru esterificarea LCFA în produse lipidice din aval (20).

Eficacitatea inerentă presupusă a LCFA neesterificată pentru a suprima transformarea poate fi simulată de analogii MEDICA. Analogii MEDICA (21) constau din acizi dioici cu lanț lung, α, ω - HOOC - C (α ′) - C (β ′) - Q - C (β) –C (α) –COOH, unde Q reprezintă un element miez cu lanț lung], substituit în αα ′ (Mαα), ββ ′ (Mββ) și/sau alți atomi de carbon opționali. Analogii MEDICA pot fi tioesterificați la co-tioesterii lor respectivi, dar aceștia nu sunt esterificați în lipide și nici transformați în ceramide, în timp ce substituțiile în pozițiile αα 'sau ββ' le blochează β-oxidarea. Analogii MEDICA sunt excretați în cea mai mare parte în bilă ca glucuronide respective. Ca atare, analogii MEDICA pot imita activitățile alosterice ale LCFA libere/neesterificate, evitând în același timp rolul lor de substraturi pentru β-oxidare sau esterificare în lipide. Mai mult, analogii MEDICA s-au dovedit a fi eficienți hipolipidemici antidiabetici într-o serie de modele animale diabetice obeze (22-24, 26), determinându-ne interesul de a studia eficacitatea dietei ketogene și MEDICA în contextul cancerului de sân.

Materiale și metode

Animale și diete

Imunohistochimie

Probele de tumoră mamară fixate în 4% formaldehidă tamponată au fost încorporate în parafină. Secțiunile (5 μm) au fost deparafuite și rehidratate prin diluții gradate de etanol, urmate de fierbere în tampon citrat de 25 mmol/L, pH 7,4, la 115 ° C timp de 3 minute. Activitatea endogenă a peroxidazei a fost blocată cu 3% peroxid de hidrogen. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpii primari, după cum s-a indicat, urmată de incubarea cu peroxidază de hrean (HRP) sau anticorpi secundari fluorescenți conjugați (laboratorul Jackson). Secțiunile incubate cu HRP au fost contracolorate cu hematoxilină. Intensitatea fluorescentă a fost analizată prin microscopie confocală utilizând DAPI pentru vizualizarea nucleelor (Zeiss LSM 710; Axio observator Z1). Plămânii au fost excizați și fixați în formalină peste noapte și apoi încorporați în parafină. Secțiunile (5 μm) au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și analizate cu ajutorul microscopiei computerizate (Ariol SL-50; Olympus BX61 Imaging Applied).

Culturi celulare

Celulele primare MMTV-PyMT au fost izolate de la șoareci MMTV-PyMT de 16 săptămâni, așa cum s-a descris anterior (25). Celulele Met-1 (Dr. Alexander Borowsky, Centrul de Medicină Comparată, Universitatea din California, Davis, Davis, CA) și celulele primare au fost cultivate în DMEM complet (Biologic Industries) suplimentat cu soluție de penicilină - streptomicină, l-glutamină și 10 % FCS, urmat de adăugarea MEDICA așa cum este indicat. Proliferarea celulară a fost cuantificată utilizând testul de albastru de metilen. Celulele Met-1 cultivate în 24 de plăci au fost transfectate cu plasmidă reporter M67-TATA-TK-LUC (1 μg), plasmide de expresie pentru STAT3 constitutiv (0,1 μg) și pentru CMV - β-galactozidază (0,1 μg), folosind ADN jetPEI reactiv de transfecție (26). După 8 ore, mediul a fost schimbat și celulele au fost tratate timp de 24 de ore cu MEDICA așa cum s-a indicat. Activitatea luciferazei normalizată la β-galactozidază a fost măsurată așa cum s-a descris anterior (26). Celulele HCC1954 (ATCC CRL-2338) au fost cultivate în RPMI-1640 (Biological Industries) suplimentate cu soluție de penicilină - streptomicină și 10% FCS și s-au adăugat MEDICA așa cum este indicat. Unde este indicat, celulele HCC1954 au fost infectate cu constructe knockout lentivirus din sh-c-Src, sh-STAT3 sau plasmide scramble (misiunea Sigma), urmate de selecția puromicinei.

Test clonogen

Celulele respectivelor plăci experimentale au fost tripsinizate. Un total de 7.500 de celule au fost placate pe o placă de 60 mm și lăsate să formeze colonii timp de 10 zile. Celulele au fost fixate cu gluteraldehidă 0,625% și colorate cu albastru de metilen. Au fost numărate coloniile care depășeau dimensiunea de 400 μm.

Liza celulară și Western blot

Celulele cultivate au fost răzuite cu 1 X tampon de liză (50 mmol/L Tris HCI pH 8,0, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EGTA, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L NaPPi, 50 mmol/L NaF, 1 mmol/L PMSF, 1 mmol/L Na Vanadat, 40 nmol/L bpVfan și cocktail inhibitor de protează (Sigma) și centrifugat timp de 15 minute la 12.500 rpm Probele de tumori congelate au fost omogenizate în tampon de liză folosind omogenizatorul Polytron Concentrația de proteine a fost determinată de BCA (Thermo Scientific) Cu excepția cazului în care se indică altfel, lizatele de proteine au fost preparate în tampon de probă SDS [62 mmol/L Tris (pH 6,8), 2,3% SDS, 0,64 mmol/L mercaptoetanol, 10% glicerol], supuse SDS-PAGE, electrotransferat pe membrane de azotat de celuloză (Schleicher & Schuell) și sondat cu primul anticorp indicat, urmat de al doilea anticorp marcat HRP. Unde este indicat, lizații de proteine au fost preparați în tampon de probă SDS lipsit de mercaptoetanol. De ECL și intensitatea a benzilor individuale a fost determinată prin densitometrie folosind Software-ul TINA 2.10.

Imunoprecipitare

Celulele MET-1 au fost incubate după cum s-a indicat. După incubare, celulele au fost clătite o dată în PBS rece și lizate cu 50 mmol/L Hepes (pH 7,4), 150 mmol/L NaCl, 10% glicerol, 1,5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EGTA, 1% Triton, 50 mmol/L β-glicerolfosfat, 25 mmol/L NaF, 1 mmol/L Na-vanadat, 40 nmol/L bpVfen, amestec inhibitor de protează (Sigma) și 17,5 mg/ml Octil beta-D-glucopiranozid (Sigma). Lizatele au fost ținute pe gheață timp de 30 de minute și centrifugate la 12.000 rpm timp de 15 minute. Lizat de 250 μg a fost incubat timp de 4 ore cu mărgele de proteină A/G (Santa Cruz Biotechnology) preîncărcate cu anticorpul indicat. Imunoprecipitatul a fost clătit de trei ori cu tampon de spălare [20 mmol/L Hepes (pH 7,4), 150 mmol/L NaCI, 0,1% Tx-100, 10% glicerol], suspendat în tampon de probă SDS și fiert timp de 8 minute. Proteinele imunoprecipitate au fost analizate prin SDS-PAGE/Western blot.