Analiza proteomei a mușchilor scheletici de la femeile cu obezitate și obezitate morbidă Diabet

Abstract

  • AK, adenilat kinază
  • AMPK, proteina kinază activată de AMP
  • CK, creatin kinază
  • GAPDH, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază
  • HOMA, evaluarea modelului homeostaziei
  • MALDI, desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice
  • MS, spectrometrie de masă
  • pI, punct izoelectric
  • TOF, timpul zborului

O pierdere a glucozei sistemice și a homeostaziei lipidice, care implică mai multe sisteme de organe, elimină bolile legate de obezitate, cum ar fi sindromul metabolic și diabetul de tip 2. Mai exact, se presupune că apar defecte în procesele metabolice cheie care dirijează intrarea, depozitarea și catabolismul oxidativ al glucozei și acizilor grași (1-4). Acum este larg acceptat faptul că mușchii scheletici joacă un rol considerabil în reglarea nivelurilor de glucoză și lipide circulante și că această capacitate este semnificativ deprimată la indivizii obezi și/sau inactivi (2,3,5). De fapt, studii recente asupra mușchilor scheletici umani au relevat o scădere a procentului de fibre musculare de tip I (oxidativ) și scăderi paralele în transportul glucozei musculare și oxidarea lipidelor la persoanele obeze cu și fără diabet de tip 2 față de subiecții de control slab, 3,5,6). Aceste observații indică o disfuncție metabolică semnificativă la nivelul mușchilor de la indivizii obezi care contribuie la dezvoltarea intoleranței la glucoză, dislipidemie și eventuala apariție a diabetului de tip 2.

mușchilor

Noile tehnici pentru constatarea imparțială a evenimentelor moleculare complexe în mușchiul scheletic bolnav, deteriorat și adaptat la efort includ utilizarea microarrays-urilor oligonucleotidice și analiza proteomică utilizând spectroscopia de masă (7-10). Deși au existat o serie de studii de microarrays ale mușchilor diabetici și obezi pe o varietate de modele experimentale animale și umane, singurul consens real este aparenta reglare descendentă a genelor care codifică enzimele metabolismului oxidativ cu obezitate și diabet (11). Deși nivelurile de transcripție ale ARNm răspund acut la întreruperile metabolice și mecanice din mușchi, acestea nu se traduc întotdeauna imediat în modificări ale abundenței produselor proteice corespunzătoare (7,9). În consecință, există un sprijin din ce în ce mai mare pentru utilizarea tehnicilor de profilare a proteinelor pentru a ajuta la producerea unei etiologii moleculare mai cuprinzătoare a remodelării musculare și a stărilor de boală.

Standardizarea electroforezei bidimensionale și identificarea din ce în ce mai rapidă a proteinelor utilizând spectroscopia de masă a făcut evaluarea de mare viteză a modificărilor expresiei proteinelor atât practice, cât și rentabile (9,12). În studiul de față, am analizat proteinele citosolice ale mușchilor scheletici de la femeile slabe, obeze/supraponderale și cu obezitate morbidă pentru a identifica enzimele care pot explica defectele metabolismului muscular. Acest studiu preliminar al extractelor citosolice solubile a identificat adenilat kinaza (AK) 1, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și aldolaza A ca fiind exprimate preferențial în extracte de mușchi de la indivizi obezi și obezi morbid față de subiecții martori slabi. Considerăm că această descoperire oferă perspective mecaniciste asupra defectelor metabolismului muscular care stau la baza progresului bolilor metabolice legate de obezitate.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Optsprezece femei au participat la această investigație, constând din 6 greutate normală (vârsta 45,1 ± 3,1 ani; IMC 23,8 ± 0,58 kg/m2; evaluarea modelului de homeostazie [HOMA] 1,10 ± 0,26), 6 supraponderale/obeze (vârsta 44,0 ± 2,8 ani; IMC 30,2 ± 0,81 kg/m 2; HOMA 1,6 ± 0,47) și 6 extrem de obezi (vârsta 37,9 ± 3,3 ani; IMC 53,8 ± 3,5 kg/m 2; HOMA 3,6 ± 1,1) pacienți supuși unei intervenții chirurgicale abdominale, în principal bypass gastric și histerectomia abdominală totală (3). Participanții la cercetare au fost clasificați în grupurile lor respective pe baza IMC și a clasificărilor supraponderale și obezității stabilite de Institutele Naționale de Sănătate (13). Criteriile IMC pentru subiecții cu greutate normală, supraponderală/obeză și extrem de obeză au fost 24,9, 25,0-34,9 și, respectiv, ≥40 kg/m 2. HOMA pentru rezistența la insulină și funcția celulelor β a fost calculat din concentrațiile plasmatice de glucoză și insulină în jeun (14). Protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul de politici și revizuiri al Universității din Carolina de Est pentru cercetarea umană și a fost în conformitate cu principiile exprimate în Declarația de la Helsinki. Consimțământul informat a fost obținut de la toți pacienții. Niciunul dintre subiecți nu a avut boli sau a luat medicamente despre care se știe că modifică metabolismul carbohidraților sau lipidelor.

Extracția digitoninei a proteinelor citosolice.

O probă de țesut rectus abdominus a fost obținută în timpul intervenției chirurgicale și tratată așa cum s-a descris anterior (3). Proteinele citosolice au fost extrase din 25-30 mg de țesut pulverizat cu azot folosind 500 μl de tampon de extracție digitonină (10 mmol/l Tevi, 0,015% digitonină, 300 mmol/l zaharoză, 100 mmol/l NaCl, 3 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l EDTA și 1 mmol/l inhibitor de protează [fluorură de fenilmetilsulfonil], pH 6,8) cu inversare ușoară la 4 ° C timp de 20 min (12). Fracția citosolică a fost separată de restul peletei celulare prin centrifugare la 500 g timp de 10 min. Peletele celulare au fost congelate rapid și depozitate la -80 ° C pentru analize viitoare. Supernatantul care conține proteină citosolică a fost transferat într-un tub curat și centrifugat la 8.000 g timp de 20 de minute. Concentrația de proteine ​​a fost determinată în supernatantul final utilizând reactivul colorant pentru testul proteinei Bio-Rad, urmând instrucțiunile producătorului (Bio-Rad, Hercules, CA). Proba a fost apoi depozitată în alicote de 500 μl în tuburi de microcentrifugă la -80 ° C.

Electroforeză bidimensională pe gel.

Cuantificare și analiză bidimensională a gelului.

Gelurile bidimensionale au fost analizate folosind pachetul software Z3 (Compugen, Tel Aviv, Israel) folosind setările recomandate de producător. Punctul izoelectric (pI) și masa moleculară au fost calculate pe baza poziției fiecărei proteine ​​în banda IPG și gelul de a doua dimensiune. Proteinele exprimate diferențial, valorile de intensitate medie și abaterile standard au fost calculate pentru fiecare punct și normalizate la punctele corespunzătoare de pe gelurile master slabe.

Pregătirea și identificarea spectrometriei de masă a proteinelor.

Petele au fost excizate cu tipul de pipetă din polipropilenă curată și transferate într-un tub de microcentrifugă care conține 100 pl de apă deionizată. Digestia triptică a fost preformată așa cum s-a descris anterior (9), iar peptidele au fost extrase și apoi uscate prin centrifugare sub vid. Peptidele uscate s-au dizolvat ulterior în 10 μl de acid trifluoroacetic 0,1% și s-au desalinizat folosind vârfuri de micropipetă C18 ZipTip (Millipore, Bedford, MA) urmând instrucțiunile producătorului. Alicote de soluții peptidice au fost reperate pe placa de desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice (MALDI). Analizele de spectrometrie de masă (MS) și spectrometrie de masă tandem (MS/MS) au fost efectuate pe un spectrometru de masă de timp de zbor ABI (TOF) -TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA) echipat cu un Nd: YAG 200 Hz laser. Instrumentul a fost operat cu extracție întârziată în modul ion reflector pozitiv. Un amestec de peptide standard a fost utilizat pentru calibrarea externă a instrumentului. Identificarea proteinelor a fost efectuată utilizând software-ul GPS Explorer (Applied Biosystems) și baza de date MASCOT. Ambele date MS și MS/MS au fost utilizate pentru identificarea proteinelor.