Amfetamina manipulează nivelul și comportamentul monoaminooxidazei-A folosind aptameri teranostici ai
Abstract
fundal
Enzimele monoaminooxidazei (MAO) joacă un rol esențial în controlul catabolismului neurotransmițătorilor monoaminei și al aminei biogene și al comportamentului la om. Cu toate acestea, mecanismele care reglementează MAO sunt neclare. Sunt propuse mai multe proteine ale factorului de transcripție pentru a modula transcripția MAO genă, dar dovezile care susțin aceste ipoteze sunt controversate. Ne-am propus să investigăm mecanismul proteinelor regulatoare ale transcripției genelor asupra comportamentului indus de amfetamină. Am aplicat aptameri care conțin o secvență de legare a ADN-ului, precum și o secvență aleatorie (fără țintă) pentru a studia modularea nivelurilor de MAO induse de amfetamină și a hiperactivității la șoareci vii.
Metode
Am pretratat la șoareci C57black6 masculi adulți (Taconic Farm, Germantown, NY) (n ≥ 3 litere la un moment dat), cu vârsta de 2 până la 3 luni (23 ± 2 gm greutate corporală) cu aptameri ADN dublu catenar (ds) cu secvență specific activator protein-1 (5ECdsAP1), nuclear factor-kappa beta (5ECdsNF-kB), protein-1 special (5ECdsSP-1) sau cyclicAMP responsive element binding (5ECdsCreB) proteine, 5ECdsRan [o secvență aleatorie fără țintă], control AP-1 monocatenar (5ECssAP-1) (8 nmol ADN per kg) sau soluție salină (5 μl, injecție intracerebroventriculară [icv]) înainte de administrarea amfetaminei (4 mg/kg, ip). Apoi am măsurat și analizat activitățile locomotorii și nivelul activității MAO-A și MAO-B.
Rezultate
În starea patologică a expunerii la amfetamine, am arătat aici că pretratarea cu 5ECdsAP1 și 5ECdsNF-kB a inversat scăderea activității MAO-A (
fundal
MAO catalizează dezaminarea oxidativă a monoaminelor endogene din corpul uman [8]. Există două izoforme ale MAO (MAO-A și MAO-B), localizate în membrana mitocondrială externă; acestea sunt distribuite în tot sistemul nervos, precum și în alte regiuni ale corpului, inclusiv în sistemul digestiv și circulator. Deficitul MAO-A rezultat din mutația în MAO-A gena poate provoca un set caracteristic de simptome (adică, întârziere mintală ușoară, comportament impulsiv antisocial și tulburări de dispoziție și de panică) denumite în mod colectiv sindrom Brunner [9]. Mutații la șoarece MAO gena conferă același fenotip [10]; prin urmare, șoarecele este un model animal ideal pentru experimentele preclinice care implică manipularea MAO-A.
Interesant este faptul că proteinele crescute ale factorului de transcripție AP-1 și NF-kB și activarea microglială sunt, de asemenea, asociații cunoscute în leziunile ischemice-reperfuzive, modelul tulburării Parkinson și infecția virală a imunodeficienței umane. Variație în MAO-A expresia a fost asociată cu polimorfisme în regiunea promotorului [11, 12], care s-a arătat, de asemenea, că conține cel puțin o secvență consens pentru legarea AP-1 și SP-1 [13-16]. Pentru a înțelege mai bine modul în care aceste două proteine TF pot influența activitatea MAO-A, am adoptat o abordare alternativă folosind un aptamer ADN dublu catenar (ds) cu secvențe consens pentru aceste proteine TF. Am demonstrat legarea specifică și sensibilă a aptamerilor dsAP1 și dsNF-kB la proteinele AP-1 și respectiv NF-kB [5], inclusiv o legare nulă la aptamerul AP-1 la șoareci cu proteine AP-1 mutante [ 17]. MAO-A se găsește în citoplasma neuronilor dopaminergici din SN, pars compacta, hipotalamus și VTA a creierului mediu. Deoarece neuronii mezolimbici ai căii de recompensă au proiecții axonale originare din VTA, am examinat antigenul MAO-A din regiunea VTA. Aici, corelăm efectul aptamerilor dsAP-1/NF-kB asupra activităților motorii cu expresia MAO-A în VTA a șoarecilor vii expuși la amfetamină.
Metode
Animale și locuințe
Toate procedurile utilizate în acest studiu au fost aprobate de Subcomitetul Spitalului General din Massachusetts pentru Cercetarea Îngrijirii Animalelor, comitetul instituțional pentru bunăstarea animalelor, în conformitate cu Ghidul serviciului de sănătate publică pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Șoareci masculi C57 negri adulți 6 (Taconic Farm, Germantown, NY) (n ≥ 3 litere la un moment dat), cu vârsta de 2 până la 3 luni (23 ± 2 gm BW), au fost ținuți în cuști pe așternutul de rumeguș, într-o cameră cu lumină controlată cicluri (12 h lumină/12 h întuneric), unde au avut acces gratuit la apă și au fost hrăniți cu chow de laborator standard. Șoarecii au fost instruiți, operați și testați în mod aleatoriu, cu un observator orbit care a efectuat testarea comportamentală.
ADNc scurt pentru proteina de legare AP1
ADN dublu catenar care conține secvența consens (notată cu litere mari) pentru proteina AP1 (5'-fluoreceină izotiocianat [FITC] -tccggcTGACTCAtcaagcg-3 'și 3'-aggccgACTGAGTagttcgc-biotin-5') au fost modificate prin fosforotioare pe care sulful o înlocuiește fără -unirea oxigenului pe legăturile fosfatice de trei, patru sau cinci nucleotide (litere mici) de la ambele capete (capace finale, EC). ADN-urile 5ECds suplimentare pentru factorii de transcripție includ SP1 (5ECdsSP-1, 5’-ctcgcCCCGCCccgatcgaa-biotină și 3’-gagcgAAAAggctagctt); factor nuclear kappa beta (5ECdsNF-κβ, 5’-agttgaAAAAGACTTTCCcaggc-biotină și 3 ’tcaactCCCCTGAAAGGgtccg) și proteina de legare a elementului de răspuns AMP ciclic (5ECdsCREB, 5’-ctctcTGACGTCAggcaat-biotină și 3’-gagagACTGCTGTccgtta). Când ADN monocatenar a fost utilizat ca martor, oligoADN a fost complet modificat prin fosforotioare.
Ambele fire ale secvențelor de legare a factorului de transcripție au fost amestecate la temperatura camerei, încălzite la 65 ° C timp de cinci minute și răcite lent pe un termociclator (1 grad picătură pe minut) la 20 ° C, la această temperatură au fost menținute timp de 30 de minute . ADN-uri scurte au fost depozitate în alicote de 0,05 ml (100 μM) la -20 ° C. Cu o oră înainte de utilizare, o alicotă a fost decongelată la temperatura camerei.
Livrare de aptameri 5ECdsDNA
Pentru studii de absorbție am anesteziat șoarecii cu O2 pur plus 2% halotan la un debit de 800 ml/min și am livrat aptameri dsDNA (8 nmol ADN pe kg, = 4 fiecare) prin injecție cu icv [18, 19], o cale acceptată de livrare pentru administrarea substanțelor de contrast la rozătoare și primate neumane [20-22]. Am livrat 8 nmol ADN pe kg (icv) pentru studii de eliminare a proteinelor TF [23]. La trei ore după livrarea ADN, am administrat soluție salină (0,1 ml, i.p.) sau amfetamină (4 mg per kg, i.p.). Asimilarea diferitelor aptamer 5EDdsDNA a fost efectuată și validată așa cum s-a descris anterior; toate fotografiile au fost obținute cu același timp de expunere, folosind o cameră CCD Himatsu pe un microscop Olympus (Optical Analysis Corp, NH) [5].
Testarea comportamentului după amfetamină
Toți șoarecii au fost precondiționați timp de cel puțin 48 de ore în cușca de testare, care a fost echipată cu un detector de locomoție [21]. Am livrat dsDNA sau un control (icv) cu trei ore înainte de a administra amfetamină [23]. După livrarea amfetaminei șoarecii au fost așezați imediat în cuștile lor de acasă, unde le-am măsurat locomoția timp de 60 de minute.
Manipularea animalelor
Pentru a minimiza efectul stresului pe care animalele îl pot experimenta fiind în medii diferite înainte și în timpul stimulării amfetaminei, fiecare șoarece a fost găzduit în aceeași cușcă pe parcursul experimentelor, care a inclus o săptămână de obișnuință într-un mediu nou. Cu trei zile înainte de tratamentul prealabil al amfetaminei, am obișnuit toate animalele administrând o injecție zilnică de soluție salină (0,25 ml) și evaluând comportamentul ca linie de bază în fiecare zi. Fiecare cușcă de acasă a fost plasată direct în sistemul automat de înregistrare înainte ca animalele să primească injecția de amfetamină. Am împărțit animalele în două grupuri pentru a primi fie amfetamină, fie salină (vehicul), pretratare pentru zilele următoare. Șoarecii nu au fost plasați niciodată într-o nouă cușcă pentru evaluarea comportamentală așa cum este descris [21].