Activitatea ERK hepatică joacă un rol în metabolismul energetic
Ping Jiao
1 Hallett Center for Diabetes and Endocrinology, Rhode Island Hospital, Warren Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI 02903, SUA
2 Școala de științe farmaceutice, Universitatea Jilin, Changchun, provincia Jilin, China
Bin Feng
1 Hallett Center for Diabetes and Endocrinology, Rhode Island Hospital, Warren Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI 02903, SUA
Yujie Li
1 Hallett Center for Diabetes and Endocrinology, Rhode Island Hospital, Warren Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI 02903, SUA
Qin He
1 Hallett Center for Diabetes and Endocrinology, Rhode Island Hospital, Warren Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI 02903, SUA
Haiyan Xu
1 Hallett Center for Diabetes and Endocrinology, Rhode Island Hospital, Warren Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI 02903, SUA
Abstract
1. Introducere
2. Materiale și metode
2.1. Reactivi și celule
Anticorpii fosfo-ERK, tERK și MEK1 au fost achiziționați de la semnalizarea celulară (Danvers, MA). Anticorpul tubulin a fost achiziționat de la Abcam (Cambridge, MA). Anticorpul MKP-3 a fost achiziționat de la Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA). Celulele Fao au fost furnizate de Dr. Zhidan Wu (Novartis Institutes for Biomedical Research) și cultivat în RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Xu și colab., 2005).
2.2. Extracția ARN și analiza PCR în timp real
Probele de ARN au fost extrase din țesuturi folosind reactivul TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) conform instrucțiunilor producătorului. Probele de ARN tratate cu DNază I au fost transcrise invers cu transcriptază inversă SuperScript III (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) și hexameri aleatori (Invitrogen) pentru a genera ADNc. Analiza PCR în timp real a fost efectuată utilizând reactivul Power SYBR Green RT-PCR (Applied Biosystems) pe ciclorul termic ABI Prism model StepOnePlus (Applied Biosystems). Fiecare reacție de 15 ul PCR conținea 1 × amestec de reacție, 5,5 mM MgSO4, 300 nM primer înainte și 300 nM primer invers. Programul de ciclare termică a fost de 50 ° C timp de 2 minute, urmat de 95 ° C timp de 10 minute timp de 1 ciclu, apoi de 95 ° C timp de 15 secunde, urmat de 60 ° C timp de 1 minut timp de 40 de cicluri. Analiza curbei de topire a fost efectuată pentru a asigura specificitatea primerilor. ARNr 28S a fost utilizat ca genă de referință în fiecare reacție. Secvențele primerilor PCR în timp real sunt următoarele:
PEPCK 5 ’CTGCATAACGGTCTGGACTTC, 3’ CAGCAACTGCCCGTACTCC
G6Pase 5 ’CGACTCGCTATCTCCAAGTGA, 3’ GTTGAACCAGTCTCCGACCA
MKP-3, 5 ’ATAGATACGCTCAGACCCGTG, 3’ ATCAGCAGAAGCCGTTCGTT
FAS, 5 ’GGCTCTATGGATTACCCAAGC, 3’ CCAGTGTTCGTTCCTCGGA
ACC1, 5 ’CGGACCTTTGAAGATTTTGTGAGG, 3’ GCTTTATTCTGCTGGGTGAACTCTC
ACC2, 5 ’GGAAGCAGGCACACATCAAGA, 3’ CGGGAGGAGTTCTGGAAGGA
PPARα 5 ’AGAGCCCCATCTGTCCTCTC, 3’ ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAA
CPT-1β 5 ’GCACACCAGGCAGTAGCTTT, 3’ CAGGAGTTGATTCCAGACAGGTA
VLCAD 5 ’TCAGGTGTTCCCATACCCATC, 3’ AAGGCGTCGTTCTTGGCAG
2.3. Analiza Western blot
Țesuturile și celulele au fost omogenizate și lizate cu tampon de liză rece cu gheață suplimentat cu inhibitori de protează. Lizatele de proteine au fost separate pe gel Bis-Tris-PAGE 4-12%, transferate pe membranele de difluorură de poliviniliden urmate de blocarea timp de 60 de minute în 1% albumină serică bovină/1 × soluție salină tamponată Tris cu Tween-20 (TBST) sau 5% lapte uscat fără grăsime/1 × TBST. Membranele au fost apoi incubate cu anticorpii primari corespunzători în prezența 1% albumină serică bovină/1 × TBST sau 5% lapte uscat fără grăsime/1 × TBST peste noapte pe un rocker la 4 ° C. După spălări aprofundate în 1 × TBST, membranele au fost expuse la anticorpi secundari corespunzători legați la peroxidază de hrean în 5% lapte uscat fără grăsime/1 × TBST timp de 1 oră la temperatura camerei. După spălări aprofundate în 1 × TBST, semnalele au fost detectate cu o soluție de detectare a Western blot de chemiluminescență (PerkinElmer, Waltham, MA) pe sistemul de imagistică fluorochimică Alpha-Inotech.
2.4. Construcția și purificarea adenovirusului
2.5. Întreținerea și analiza șoarecilor
2.6. Teste de toleranță la glucoză și insulină
Pentru testul de toleranță la glucoză (GTT), șoarecii au fost postiti peste noapte și apoi injectați cu glucoză la doza de 2g/kg pentru șoareci masculi hrăniți cu chow sau la doza de 0,75g/kg pentru șoareci DIO. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate la 0, 15, 30, 45, 60 și 90 de minute după injectare. Pentru testul de toleranță la insulină (ITT), șoarecii au fost posti timp de 6 ore și injectați cu insulină la doza de 0,5 U/kg pentru șoarecii masculi hrăniți cu chow și 1,5 U/kg pentru șoarecii DIO. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate la fiecare 15 minute până la 90 de minute după injectare.
2.7. Calorimetre indirecte
Consumul de oxigen (VO2), producția de dioxid de carbon (VCO2) și aportul de alimente au fost măsurate individual timp de 24 de ore utilizând sistemul cuprinzător de monitorizare a animalelor de laborator (Columbus Instruments, Columbus, OH) după o zi de aclimatizare. În timpul experimentului, șoarecii au avut acces gratuit la alimente și apă. Cheltuielile de energie au fost calculate utilizând următoarea formulă: VO2 × (3,815 + 1,232 × RQ) și normalizate în raport cu greutatea corporală a animalului și corectate în funcție de o valoare efectivă a masei, care este masa corporală 0,75 .