Activitatea anti-HIV-1 a lui Elafin depinde de localizarea sa nucleară și de imunitatea înnăscută modificată

Anna G. Drannik

1 Departamentul de patologie și medicină moleculară, Centrul de cercetare în imunologie McMaster, Institutul Michael G. DeGroote pentru cercetarea bolilor infecțioase, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada,

Kakon Nag

1 Departamentul de Patologie și Medicină Moleculară, Centrul de Cercetare în Imunologie McMaster, Institutul Michael G. DeGroote pentru Cercetarea Bolilor Infecțioase, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada,

Xiao-Dan Yao

Bethany M. Henrick

T. Blake Ball

2 Departamentul de Microbiologie Medicală, Universitatea din Manitoba și Agenția de Sănătate Publică din Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada,

Francis A. Plummer

2 Departamentul de Microbiologie Medicală, Universitatea din Manitoba și Agenția de Sănătate Publică din Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada,

Charles Wachihi

3 Departamentul de Microbiologie Medicală, Universitatea din Nairobi, Nairobi, Kenya,

Joshua Kimani

3 Departamentul de Microbiologie Medicală, Universitatea din Nairobi, Nairobi, Kenya,

Kenneth L. Rosenthal

Conceput și proiectat experimentele: AGD KN KLR. A efectuat experimentele: AGD. Analiza datelor: AGD KN X-DY. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: KN X-DY BMH TBB FP CW JK. Am scris lucrarea: AGD KN KLR.

Abstract

Introducere

Tr și E (Tr/E) sunt antiproteaze de alarmă și regulatoare ale imunității mucoasei, cu proprietăți antimicrobiene, imunomodulatoare și de reparare a țesuturilor bine documentate [23], [24]. Tr/E sunt membri ai familiei de proteine acide din zer (WAP) care conține un nucleu caracterizat și evolutiv conservat cu patru disulfuri (FDC) sau domeniu WAP, implicat în inhibarea proteazei [25], [26]. Tr (9,9 kDa) este o moleculă precursor secretată care are două domenii. În domeniul său N-terminal, Tr conține un domeniu de legare a substratului transglutaminazei (TSBD), permițând cuplarea Tr la proteinele matricei extracelulare [27]. Scindarea proteolitică a capătului N-terminal al Tr produce elafină (E) (5,9 kDa), conținând un domeniu inhibitor WAP [28] și un TSBD [29].

Similar cu omologul lor structural, inhibitor secretiv al proteazei leucocitelor (SLPI) [26], Tr/E posedă activitate antimicrobiană împotriva bacteriilor, ciupercilor și virusurilor, inclusiv HIV-1 [11], [23], [30], [31] . Au fost propuse mai multe mecanisme ale activității antimicrobiene Tr/E, inclusiv interacțiunea lor directă cu membrana celulară microbiană datorită naturii cationice a acestor molecule [31], opsonizarea bacteriană [32] și legarea la ADN-ul bacterian [33]. De asemenea, s-a arătat că Tr/E posedă proprietăți imunomodulatoare [24]. Sa demonstrat că E inhibă eliberarea declanșată de LPS de MCP-1 în monocite [34], în timp ce Tr/E a redus secreția IL-8 și TNFα ca răspuns la elastaza umană, LPS și LDL oxidat în celulele endoteliale și macrofage TNF [35]. ]., [36]. Această imunomodulare a fost atribuită legării la LPS [35] sau inhibării activării căilor NF-κB și AP-1 [34]. Aceste descoperiri demonstrează natura pleiotropă a Tr/E și contribuția lor la apărarea gazdei la niveluri diferențiale: vizând atât agenții patogeni, cât și răspunsurile imuninflamatoare ale gazdei.

Tr/E au fost, de asemenea, legate de tulburări inflamatorii ale plămânului [37], [38], intestinului [39] și pielii [25]. Tr/E sunt exprimate constitutiv în secrețiile mucoasei [9], [11] și pot fi induse ca răspuns la IL-1β, TNFα și poliI: C [3], [11], [40]. Tr/E sunt produse de mai multe tipuri de celule, inclusiv EC genitale [3], [11], [40] și au fost identificate în fluidul de spălare cervicovaginală (CVL) [22], [30]. Împreună cu SLPI și o mulțime de alte molecule efectoare, și anume defensine, serpine, cistatine, lizozimă și lactoferină, Tr/E joacă un rol semnificativ în protejarea FGT împotriva ITS, inclusiv HIV-1 [9], [11] ], [12], [30], [41], [42].

Materiale și metode

Reactivi și linii celulare

Acidul polinozinic/policitidilic (poliI: C) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) a fost reconstituit în PBS la concentrația indicată. Carcinom endometrial uman (HEC-1A, ATCC # HTB-112 ™, depus de Dr. H. Kuramoto) și TZM-bl (JC53-BL) (ATCC # PTA-5659, brevet SUA numărul 6.797.462, contribuit de Dr. John Kappes și celulele Xiaoyun Wu) au fost obținute din colecția American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, SUA) și menținute în McCoy's 5A Medium Modified (Invitrogen Life Technologies, Burlington, Ontario, Canada) și, respectiv, DMEM, completate cu 10% fetal ser bovin, 1% HEPES (Invitrogen Life Technologies), 1% l-glutamină (Invitrogen Life Technologies) și 1% penicilină-streptomicină (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canada) la 37 ° C și 5% CO2.

Test de inhibare a proteazei

Activitatea inhibitoare a elastazei a fost măsurată așa cum s-a descris anterior [30], [43]. Pe scurt, proteina Tr/E (volumul final 10 pl/godeu), sau diluant singur, a fost combinată într-o placă cu 96 de godeuri cu 50 ng în 10 pl/godeu de elastază neutrofilă umană purificată (HNE) (Sigma-Aldrich) sau diluant singur (martor negativ) și incubat timp de 30 de minute la 37 ° C. Ulterior, 50 μl de substrat HNE, N-metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilidă (Sigma-Aldrich), diluat la 50 μg/ml în tampon (50 mM Tris, 0,1% Triton, 0,5 M clorură de sodiu, s-a adăugat pH 8). Hidroliza a fost măsurată prin monitorizarea absorbanței la 405 nm timp de 15 minute folosind un cititor ELISA Tecan Safire (MTX Labs Systems).

Participanții la studiu

Participanții la studiu au fost descriși mai detaliat în altă parte [30]. Pe scurt, femeile dintr-o cohortă de CSW-uri Pumwani din Nairobi, Kenya, au fost înscrise în timpul cercetărilor bianuale programate în două grupuri de studiu: HIV-R, HIV-S. Aceasta este o cohortă continuă, deschisă, cu participanți înscriși între 1989 și 2009. În cadrul cohortei, femeile care au rămas HIV negative timp de 7 ani de urmărire, conform evaluării atât prin serologie, cât și prin RT-PCR, și care erau clinic sănătoase și libere de infecțiile cu transmitere sexuală (ITS) concomitente, precum și au rămas active în munca sexuală au fost considerate relativ rezistente la HIV HIV-R [44] _. Participanții, care au fost CSW neinfectați cu HIV, dar care au fost urmăriți de mai puțin de 7 ani, au fost definiți ca HIV-S. Toți participanții la cohortă aveau medii socio-economice și genetice similare. Niciun CSW înscris în acest studiu nu sa dovedit a avea ITS coexistente. Protocoalele de studiu au fost aprobate de comisiile de revizuire a eticii de la Universitățile din Nairobi, Manitoba și McMaster. Toți participanții au oferit consimțământul semnat și informat.