Activarea canalului TRPV1 de către capsaicina dietetică îmbunătățește remodelarea grăsimilor viscerale
Abstract
fundal
Prevalența obezității a crescut dramatic la nivel mondial și a atras atenția tot mai mare, dar mecanismul este încă neclar. Studiile anterioare au dezvăluit că canalele vaniloide 1 (TRPV1) potențiale ale receptorului tranzitoriu participă la pierderea în greutate prin îmbunătățirea nivelurilor intracelulare de Ca 2+. Cu toate acestea, mecanismul potențial al efectului capsaicinei dietetice asupra obezității nu este pe deplin înțeles. Transferul de Ca 2+ indus de moleculele conexin43 (Cx43) între celulele cuplate participă la diferențierea adipocitelor. Nu se cunoaște dacă modificările evocate de TRPV1 în comunicarea adipocită-adipocită mediate de Cx43 joacă un rol în obezitate.
Materiale și metode
Am investigat dacă Cx43 a participat la lipoliza adipocitelor mediată de TRPV1 în preadipocite 3T3-L1 cultivate și în țesuturile adipoase viscerale de la om și șoareci de tip sălbatic (WT) și deficienți de TRPV1 (TRPV1 -/-).
Rezultate
TRPV1 și Cx43 co-exprimate în țesutul adipos mezenteric. Activarea TRPV1 de către capsaicină a crescut afluxul de Ca 2+ în preadipocite 3T3-L1 și a favorizat lipoliza celulară, așa cum se arată prin colorarea cu roșu ulei. Aceste efecte au fost deficiente atunci când s-a administrat capsazepină, un antagonist al TRPV1, și acid 18 alfa-gliciretinic (18α-GA), un inhibitor al joncțiunii gap. Capsaicina dietetică cronică pe termen lung a redus greutățile țesuturilor perirenale, mezenterice și adipoase testiculare la șoarecii WT hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Capsaicina a crescut nivelurile de expresie ale p-CaM, Cx43, CaMKII, PPARδ și HSL în țesuturile adipoase mezenterice de la șoareci WT hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi, șoareci db/db, precum și la oameni obezi, dar aceste efecte ale capsaicinei au fost absente în TRPV1 -/- șoareci. Capsaicina dietetică cronică pe termen lung a scăzut greutatea corporală și lipidele serice ale șoarecilor WT, dar nu și șoarecii TRPV1 -/-, hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi.
Concluzie
Acest studiu a demonstrat că activarea cu capsaicină a TRPV1 evocată a crescut influxul de Ca 2+ în comunicarea adipocită-adipocită mediată de Cx43 promovează lipoliza atât in vitro, cât și in vivo. Activarea TRPV1 de către capsaicina alimentară îmbunătățește remodelarea grăsimilor viscerale prin reglarea în sus a Cx43.
fundal
Materiale și metode
Tratamentul animalelor și proceduri experimentale
Caracteristici ale subiecților
Am recrutat subiecți bărbați obezi și aceștia au fost clasificați dacă circumferința taliei era mai mare de 90 cm în conformitate cu criteriile asiatice ale Biroului regional al OMS pentru Pacificul de Vest/Asociația Internațională pentru Studiul Obezității/Grupul Internațional de Obezitate. S-au obținut vârsta, indicele de masă corporală, circumferința taliei. Țesuturile grase viscerale au fost obținute de la pacienți în timpul colecistectomiei programate regulat. Colecistectomia trebuia efectuată din cauza calculilor biliari simptomatici. Protocolul a fost aprobat de Comitetul de Etică local. Toți subiecții au dat consimțământul scris în scris.
Examen histopatologic
Țesutul adipos a fost curățat cu soluție salină și ponderat. Grăsimile viscerale de la șoareci WT și umani au fost observate cu tehnici de felie de îngheț și colorate cu anticorpi anti-TRPV1 sau Cx43 [20]. TRPV1 și Cx43 în preadipocite 3T3-L1 izolate sau adipocite cultivate primar din țesut adipos visceral au fost identificate prin colorare imunofluorescentă. Preadipocitele 3T3-L1 au fost cultivate, fixate și colorate cu colorant lipofil roșu ulei O (Sigma-Aldrich). Colorarea roșie a arătat picături de lipide în citoplasmă, indicând numărul de picături de lipide în preadipocite 3T3-L1 conform tehnicilor stabilite [26].
Test de cultură celulară și diferențiere a adipocitelor
Măsurarea intracelulară a calciului liber
Celulele 3T3-L1 crescute pe suport de sticlă au fost încărcate cu indicatorul Ca 2+ Fura-2 (2 μmol/L, Invitrogen, Paisley, Marea Britanie) și 0,025% Pluronic F-127 într-o soluție salină fiziologică timp de 40 min la temperatura camerei în întunericul. [Ca 2+] eu a fost măsurată folosind un cititor de plăci fluorescente (Varioskan Flash, Thermo) la emisie de 510 nm, cu lungimi de undă de excitație de 340 nm și 380 nm. Modificările din [Ca 2+] eu au fost calculate din rapoartele creșterilor tranzitorii ale intensității fluorescenței la 340 nm și 380 nm [8].
Recuperarea fluorescenței după albirea foto (FRAP)
Analiza imunoblotării
Imunoblotarea TRPV1, Cx43, p-CaM, CaMKII, PPARδ, HSL, β-actină și GAPDH au fost efectuate folosind tehnici standard pentru țesutul adipos și celulele adipoase mature. Anticorpul primar pentru TRPV1 a fost achiziționat de la Alomone, Israel și alți anticorpi primari au fost de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SUA). După incubarea cu anticorpii secundari timp de 1 oră, proteinele au fost detectate prin chemiluminescență sporită și cuantificate folosind un Gel Doc 2000 Imager (Bio-Rad).
Măsurarea trigliceridelor și a acidului gras liber din celule
Lipidele totale au fost extrase din preadipocite 3T3-L1 folosind un amestec de cloroform-metanol (2: 1, vol/vol). Nivelurile de trigliceride și acizi grași liberi au fost cuantificate folosind kitul ELISA (Applygen Technologies Inc., China) conform instrucțiunilor producătorului. Extractele celulare au fost colectate și centrifugate la viteza de 10000 rpm timp de 15 minute pentru a obține supernatantul. Apoi, 100 pl de supernatant și 50 pl de enzimă conjugată au fost adăugați la placa furnizată cu 96 de godeuri timp de 1 oră la 37 ° C, în timp ce curba standard a fost realizată în aceeași placă. După aceea, fiecare godeu a fost spălat cu soluția de spălare diluată de 5 ori, uscat bine cu hârtie absorbantă. Apoi s-au adăugat cu succes 50 pl de substrat A și 50 pl de substrat B și placa a fost incubată la 37 ° C timp de 15 min. În cele din urmă, soluția de stop 50 μl a fost apoi adăugată la fiecare godeu și valorile OD450 au fost măsurate cu Varioskan Flash, Thermo.
analize statistice
Datele au fost exprimate ca media ± SEM de la trei la 3-15 experimente independente sau șoareci. Comparațiile între grupuri au fost analizate folosind Student’s t test sau ANOVA unidirecțional cu testul post hoc de comparație multiplă a lui Bonferroni (GraphPad Prism; La Jolla, CA, SUA). Cu două cozi valori mai mici de 0,05 au fost considerate pentru a indica semnificația statistică.