AccQTag și AccQTag Ultra pentru derivitizarea aminoacizilor Waters
Analiza aminoacizilor prin cromatografie lichidă și detectare optică necesită pregătirea suplimentară a probelor, deoarece majoritatea aminoacizilor nu au un cromofor și nu pot fi detectați. Astfel, după hidroliză, următorul pas într-o analiză a aminoacizilor este derivatizarea. Această secțiune descrie prepararea hidrolizatelor de proteine sau peptide pentru derivatizare utilizând Waters AccQ • Tag chimie.
Pentru a deriva corect și în mod fiabil o probă hidrolizată, trebuie luate în considerare următoarele:
- Îndepărtarea particulelor
- Determinarea masei probei pentru derivatizare
- Determinarea dacă este necesară neutralizarea eșantionului
- Utilizarea reactivului de derivatizare în exces pe baza masei probei
Următoarele discuții sunt prescurtate din necesitate. Pentru informații suplimentare și îndrumări despre AccQ • Chimie de derivatizare a etichetelor, vă rugăm să vizitați www.waters.com/AAA.
Centrifugarea poate fi necesară dacă sunt prezente cantități mari de particule sau lipide plutitoare. Centrifugarea face mai ușoară extragerea unei alicote de hidrolizat clar pentru derivatizare.
Pentru probele cu volum mare, cum ar fi hidrolizate de analiză a furajelor, filtrarea particulelor poate fi suficientă, observându-se că recuperarea probelor poate fi afectată de alegerea materialului filtrant. Acest factor trebuie luat în considerare și abordat pentru a obține rezultate imparțiale. Contactați producătorul filtrului pentru detalii privind performanța filtrului în această aplicație.
Metoda AccQ • Tag este o tehnică de derivatizare precolumnă pentru analiza aminoacizilor peptidei și proteinelor hidrolizate. Metoda AccQ • Tag realizează următoarele:
- Folosește Waters AccQ • Tag Ultra sau AccQ • Fluoride ™ Reagent pentru a deriva aminoacizii
- Separează derivații folosind HPLC sau UPLC în fază inversă pe bază de gradient
- Cuantifică cu precizie derivații utilizând standarde externe de aminoacizi și detectare optică
Reactivul 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamat (AQC) reacționează atât cu amine primare, cât și cu amine secundare. Excesul de reactiv AQC reacționează cu apă pentru a forma 6-aminoquinolină (AMQ). AMQ reacționează lent cu excesul de reactiv AQC pentru a forma o bis uree. Aceste produse secundare nu interferează cu separarea, identificarea și cuantificarea aminoacizilor conținuți în peptidele sau hidrolizatele proteice. Derivații sunt stabili timp de zile, permițând prelucrarea în serie sau analiza repetată, dacă se dorește.
De-a lungul mai multor ani, au fost efectuate studii ample pentru a asigura acuratețea reacției de derivare AccQ • Tag. Reacția chimică în sine necesită atât un exces molar de reactiv de derivatizare, cât și un pH bazic (8-10) pentru derivatizarea completă a tuturor aminoacizilor. Au fost dezvoltate strategii pentru a aborda acești factori critici.
6.3.1 Determinarea cantității de eșantion pentru AccQ • Derivatizarea etichetei
În reacția însăși, proba este de obicei diluată de 10x și 1 uL dintr-un volum total de derivare de 100 uL este injectat pe coloană. Deoarece nu toți aminoacizii sunt prezenți în aceeași cantitate într-o derivatizare, cantitatea de probă trebuie să fie suficientă pentru ca aminoacidul cel mai puțin abundent să aibă impact asupra limitei de detectare sau cuantificare. Derivatizarea a cel puțin 1 pmol din cel mai puțin abundent aminoacid, într-un volum maxim de injecție de 1 µL, este recomandată pentru a obține o cuantificare precisă. Pentru a determina cantitatea de eșantion necesară, efectuați următorul calcul:
➢ Exemplu de calcul:
Pentru o concentrație de probă de 1,0 mg/ml proteină:
Estimează cantitatea de probă necesară pentru cel mai puțin abundent aminoacid. În acest exemplu, presupunem că este necesară 0,03 mg/ml pentru a furniza 1 pmol pe o coloană a acestui aminoacid.
Pasul 1: Determinați concentrația molară aproximativă a aminoacidului cel mai puțin abundent.
Conversia mg în moli (greutatea moleculară medie a unui reziduu de aminoacizi într-o proteină este de 110).
Aceasta este concentrația estimată a aminoacidului cel mai puțin abundent din această probă.
Pasul 2: Determinați diluția necesară pentru a da 1 pmol din acest aminoacid cel mai puțin abundent pe coloană.
Aceasta oferă o diluție de 27 de ori (10 ÷ 0,37 = 27).
Hidrolizatul necesită o diluție de 27 de ori înainte de derivatizare. De exemplu: 5 pl din proba de hidrolizat poate fi diluată prin 135 µL de 0,1 N HCI pentru a produce această valoare țintă.
În cele din urmă, o alicotă de 10 pl din diluția de mai sus poate fi transferată în flaconul de derivatizare.
6.3.2 Neutralizare pentru AccQ • Derivatizarea etichetei
Pentru a asigura o derivare completă a reactivului AccQ • Tag al aminoacizilor conținuți în hidrolizat, proba trebuie tamponată într-un interval de pH aproximativ de 8,2 până la 10,1. Dacă acidul hidrolizat nu este neutralizat corespunzător și dacă pH-ul scade sub 8,2, derivatizarea va fi incompletă. Efectul pH-ului variază pentru fiecare aminoacid. Rețineți că nu toți aminoacizii sunt afectați în mod egal. Aminoacizii acizi, cum ar fi acidul glutamic și alanina, sunt afectați mai mult decât serina sau fenilalanina. pH-ul este un factor critic în obținerea cuantificării exacte a tuturor aminoacizilor din proba originală.
- Dacă soluția de aminoacizi este dizolvată în 0.1N HCI, 10-20 µL de probă pot fi transferați direct la cocktailul de derivatizare fără ajustarea pH-ului. oși:Este încă necesară o tensiune care să fie posibilă o federalizare a excesului de reactivare, așa cum este descris mai jos.
- Dacă soluția de aminoacizi se află într-o concentrație mai mare de acid (> 0,1 N HCI), aceasta trebuie neutralizată cu un volum egal de hidroxid de sodiu la aceeași concentrație. Acest lucru poate fi realizat fie ca adaos de volum masiv, fie integrat în etapa de derivatizare.
- Se înlocuiește cantitatea necesară de tampon de borat cu NaOH pentru a neutraliza HCI din probă.
- În amestecul flaconului de reacție de derivatizare, așezați 10 pl de NaOH xM și 60 pl de borat. Se adaugă 10 uL din proba AA (în xN HCI). Derivați cu 20 µL de reactiv AccQ • Fluor.