Un model de șoarece cu leziuni ale măduvei spinării de tranziție completă, realizat prin două operații - Li - Analele
Chen Li 1,2,3 #, Xingfei Zhu 1,2 #, Chia-Ming Lee 3, Zhourui Wu 1,2, Liming Cheng 1,2
Contribuții: (I) Concepție și proiectare: C Li, Z Wu, L Cheng; (II) Sprijin administrativ: L Cheng; (III) Furnizarea de materiale de studiu sau pacienți: C Li, Z Wu; (IV) Colectarea și asamblarea datelor: CM Lee, X Zhu; (V) Analiza și interpretarea datelor: toți autorii; (VI) Scrierea manuscriselor: Toți autorii; (VII) Aprobarea finală a manuscrisului: Toți autorii.
# Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.
Fundal: Tot mai multe studii s-au concentrat pe tratamentul leziunii măduvei spinării (SCI) prin ingineria țesuturilor, dar încă nu există un model animal ideal care să poată simula în mod real și obiectiv procesul patologic real în practica clinică. De asemenea, având în vedere disponibilitatea și utilizarea crescândă a animalelor modificate genetic în cercetarea științifică de bază, a devenit esențial să se dezvolte modele clinice pentru SCI pentru utilizare la șoareci.
Metode: Patruzeci și opt de șoareci C57BL/6 au fost împărțiți în trei grupuri (răniți/simulați/nevătămați). Am determinat intervalul cicatricial făcut de prima leziune prin zdrobire prin observarea specimenului, colorarea hematoxilinei și eozinei (HE) și colorarea imunofluorescentă. Tranziția pentru îndepărtarea completă a unui segment de măduva spinării de 2 mm centrat pe nucleul leziunii a fost finalizată la 6 săptămâni după prima leziune în grupurile rănite, în timp ce grupul fals a suferit doar o reexpoziție a măduvei spinării fără leziune de tranziție. Caracteristicile acestui model SCI au fost pe deplin constatate prin observarea specimenului, colorarea HE, colorarea imunofluorescentă și reacția în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qRT-PCR).
Rezultate: Nu au murit șoareci după prima leziune. Rezultatele histopatologice au sugerat un ciclu ciclic de 2 mm. După a doua operație, au murit 2 șoareci din grupul rănit și 1 șoarecel din grupul fals. Scorul Basso Mouse Scale (BMS) și rezultatele potențialului motor evocat (MEP) au arătat că funcția neurologică a șoarecilor nu și-a revenit. Imunomarcarea a arătat că nu au existat neuroni sau reziduuri de neurofilamente în nucleul leziunii la 4 săptămâni după a doua leziune. Astrocitele au încapsulat celule imune pentru a forma cicatrici gliale dense. Majoritatea celulelor imune au fost limitate la miezul leziunii și au format cicatrici fibroase cu fibroblaste. În același timp, a existat o angiogeneză considerabilă în nucleul leziunii și în jurul leziunii. Rezultatele qRT-PCR au arătat că Ptprc a fost extrem de exprimat în nucleul leziunii, în timp ce Gfap, nestin, Cnp și Sv2b au fost extrem de exprimate în regiunea adiacentă. Acest lucru sugerează că nucleul leziunii este o zonă foarte inflamatorie, dar poate exista neurogeneză spontană adiacentă nucleului leziunii.
Concluzii: Modelul SCI de tranziție completă a mouse-ului realizat de cele două operații are o simulare bună, fezabilitate ridicată și reproductibilitate ridicată; va fi un instrument util pentru testarea preclinică a tratamentului SCI.
Cuvinte cheie: Leziunea măduvei spinării (SCI); model animal; metoda chirurgicală; histopatologie
Trimis pe 09 septembrie 2019. Acceptat pentru publicare 02 ianuarie 2020.
Introducere
Leziunea măduvei spinării (SCI) a jucat întotdeauna un rol esențial în domeniul bolilor traumatice ale coloanei vertebrale din cauza incidenței sale ridicate, a ratei ridicate de invaliditate și a ratei reduse de recuperare (1,2). Până în prezent, tratamentul eficient și reabilitarea SCI rămân o problemă medicală dificilă la nivel mondial (3). Conform statisticilor recente, incidența SCI în lume este de 10,4-83/1 milion (4). Consecințele grave, cum ar fi paralizia cauzată de SCI, impun adesea sarcini substanțiale asupra familiilor și societății (5). Prin urmare, stabilirea unui model animal standard și ideal al SCI este o condiție prealabilă pentru studiul experimental al SCI.
În ultimii 10 ani, s-au înregistrat progrese semnificative în tratamentul SCI prin implantarea celulelor stem și a materialelor biologice funcționale în siturile rănite, îmbunătățind astfel micro-mediul, activând celulele stem neuronale endogene și promovând regenerarea neuronilor și axonilor ( 6-9). Cu toate acestea, majoritatea acestor metode se bazează pe modele animale acute SCI, cum ar fi modelul de tranziție ascuțită (10,11), modelul de rănire prin comprimare (12), modelul de rănire prin zdrobire (13), modelul complet de leziune de tranziție (9) și așa el. Aceste studii au transplantat celule sau biomateriale imediat după SCI, eludând efectele cicatricilor gliale și cicatricilor fibroase asupra regenerării nervilor. Cu toate acestea, în lucrările clinice, din cauza prognosticului imprevizibil cauzat de limitarea tehnicilor de diagnostic existente (14), în stadiul incipient al leziunii, în care materialele de speriat încă nu s-au format, majoritatea pacienților nu sunt de acord cu transplantul chirurgical de tulpină celule, biomateriale sau alte tratamente, cu excepția cazului în care nu există nicio îmbunătățire a paraliziei pe termen lung. Prin urmare, îndepărtarea țesutului cicatricial este esențială pentru tratamentul SCI. Stabilirea unui model animal adecvat de îndepărtare a țesutului cicatricial poate simula cu acuratețe, realism și obiectiv procesul real de tratament clinic în practica clinică.
Metode
Chirurgie la animale
Test de câmp deschis
Testul de câmp deschis Basso Mouse Scale (BMS) a fost utilizat pentru a evalua funcția motorie a membrelor posterioare la șoareci. În mod dublu orb, șoarecii au fost evaluați o dată pe săptămână înainte și după rănire de către aceiași doi observatori care nu erau conștienți de condițiile experimentale.
Analiza electrofiziologică
Testarea electrofiziologică a fost efectuată pentru fiecare grup utilizând potențialul evocat cu două canale Keypoint II/electromiografie (Dantech) în fiecare săptămână după prima leziune și a patra săptămână după a doua leziune. Toate animalele au fost anesteziate prin injecții intramusculare (IM) de ketamină (20 mg/kg). Potențialul evocat motor (MEP) se referă de obicei la potențialul de acțiune provocat de stimularea cortexului motor. Pentru înregistrarea MEP, au fost incluși 2 electrozi de stimulare: electrodul pozitiv a fost plasat pe suprafața craniului zonei motorii a cortexului cerebral [antero-posterior (AP) ± 1,0, stânga/dreapta ± 1,5, dorso-ventral (DV) 0, mm de bregma], 1 mm în spatele bregmei și 1,5 mm pe partea stângă sau dreaptă de la linia mediană; iar electrodul negativ a fost plasat pe craniu 0,5 cm lateral față de electrodul pozitiv. Electrodul de înregistrare a fost introdus în mușchiul gastrocnemius stâng sau drept al membrelor posterioare la o adâncime de 1,5 mm.