Transcriere crescută a genei QSOXX1 care codifică Quiescin Q6 Sulfhidril oxidaza 1 în cancerul de sân

Afiliație Școala de Științe Biologice, Centrul pentru Științe Biomedice, Universitatea Royal Holloway din Londra, Londra, Regatul Unit

Mihail Soloviev,
Michelle P. Esteves,
Fakhria Amiri,
Mark R. Crompton,
Christopher C. Rider

Cifre

Abstract

Citare: Soloviev M, Esteves MP, Amiri F, Crompton MR, Rider CC (2013) Transcrierea elevată a genei QSOX1 care codifică Quiescin Q6 Sulfhydryl Oxidase 1 în cancerul de sân. PLOS ONE 8 (2): e57327. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057327

Editor: Jun Li, Facultatea de Medicină a Universității Sun Yat-sen, China

Primit: 16 septembrie 2012; Admis: 21 ianuarie 2013; Publicat: 27 februarie 2013

Finanțarea: Autorii nu au sprijin sau finanțare de raportat.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Este bine stabilit că brațul cromozomului 1q este supus amplificării la nivelul ADN în aproximativ 50-60% din cancerele de sân [1] - [3]. Deși aceasta nu este singura amplificare cromozomială în această boală, este una dintre cele mai mari și mai frecvente și a fost interpretată ca reprezentând un eveniment precoce în carcinogeneza sânilor [1]. Estimările dimensiunii și numărului de ampliconi individuali implicați variază, dar studii de hibridizare genomică comparativă cu rezoluție înaltă mai recente au indicat faptul că, deși întregul braț q poate fi amplificat, regiunile 1q21.1–1q31.1 și 1q32.1–1q44 sunt cel mai frecvent afectat [4], [5]. Spre deosebire de 1q, brațul 1p prezintă o amplificare mică, având adesea o pierdere a numărului de copii [1], [3] - [5]. Cu toate acestea, semnificația funcțională a amplificării genei 1q rămâne necunoscută. Așa cum ar fi de așteptat, numărul copiei genetice este asociat cu supraexprimarea ARNm în țesutul cancerului de sân, dar corelația de aici este mai puțin decât completă. Un studiu privind microarray-ul ADNc a arătat că 44% dintre genele foarte amplificate sunt puternic supraexprimate în cancerul de sân, dar la fel și 6% din gene cu un număr normal de copii [6].

Deoarece întregul braț 1q este supus amplificării genelor, am emis ipoteza că cartografierea mai multor gene în această regiune genomică este importantă în tumorigeneză și/sau progresie a cancerului de sân. Cu toate acestea, după cunoștințele noastre actuale, doar două gene 1q, COX2 [7], [8] și peroxiredoxin-6/PRDX6 [9] s-au dovedit până acum că sunt supraexprimate în cancerul de sân și au roluri cheie în metastază și supraviețuirea celulelor canceroase . Se știe că o altă genă 1q, nectina-4/PVRL4, este supraexprimată, dar semnificația patologică a acesteia este încă neclară [10]. Pentru a investiga dacă alte gene 1q ar putea fi supraexprimate în cancerul de sân, am analizat nivelurile lor de ARNm în țesutul mamar normal și canceros utilizând analiza în serie a expresiei genice (SAGE) și a datelor EST colectate în proiectul Cancer Genome Anatomy Project (http: // cgap.nci.nih.gov). Rezultatele acestor analize arată că mai multe gene prezintă niveluri deosebit de ridicate de supraexpresie, inclusiv QSOX1 (NM_002826) care codifică enzima quiescin Q6 sulfhidril oxidază 1. Această enzimă aparține unei familii de flavină adeninedinucleotidă (FAD) dependentă de sulfhidril oxidaze [11].

Am confirmat descoperirile noastre bioinformatice pentru QSOX1 experimental, prin efectuarea RT-PCR, 3'RACE PCR și PCR cantitativă în timp real. Am identificat o nouă formă extinsă 3'UTR a transcrierii QSOX1 și am arătat că gena este într-adevăr supraexprimată în cancerele de sân cu prognostic slab. Datele noastre identifică QSOX1 ca o genă demnă de investigații detaliate suplimentare pentru a defini relevanța sa în patogeneza și progresia acestei boli.

Rezultate

Supraexprimarea și extinderea 3 ′ a transcrierilor QSOX 1 în cancerul de sân

Pentru a investiga dacă amplificarea frecventă a genei brațului q al cromozomului 1 ar putea fi asociată cu supraexprimarea genelor situate în această regiune, am investigat o pereche de biblioteci SAGE potrivite folosind instrumentul DGED. Datele SAGE au arătat că 156 de gene 1q braț suferă o reglare transcripțională în carcinomul ductal al sânului comparativ cu țesutul mamar normal. Reglarea ascendentă a aproximativ o treime din aceste gene a fost considerată semnificativă (P≤0,05) și 25 dintre aceste gene prezintă o reglare ascendentă foarte semnificativă (P≤0,01). Ultimele gene reglate în sus sunt enumerate în Tabelul 1 în ordinea celui mai înalt grad de supraexprimare a acestora în cancerul de sân; gene cu (0,01

Panou A prezintă ADNc amplificat folosind primerii 45-F și 46-R (lungimea preconizată 550 bp). Panou prezintă ADNc amplificat folosind primerii 43-F și 44-R (lungimea așteptată 735 bp). Alte amplificări PCR foloseau grunduri: 63-F cu 64-R (panou C, dimensiunea așteptată 836 bp), 47-F cu 48-R (panou D, dimensiunea așteptată 922 bp), 49-F cu 50-R E, 825 bp), 53-F cu 36-R (panou F, 883 bp), 23-F cu 54-R (panou G, 620 pb). Panou H prezintă ADNc amplificat al versiunii solubile a QSOX1 (QSOX1b) folosind primerii 17-F și 18-R (lungimea așteptată 814 bp). Panou Eu prezintă dimensiunea fragmentului de ADNc amplificat cu primerul senzitiv specific (106-Int-F) și primerul adaptor 3 ′ RACE antisens (Adap-1-R). Specificitatea amplificării (identitatea tuturor produselor PCR amplificate) a fost confirmată în continuare prin secvențierea ADN pentru toate produsele amplificate.

Pentru a identifica capătul real 3 ′ al ADNc QSOX1 extins, am efectuat 3′-RACE-PCR folosind un set de primerii specifici cuibăriți și un set de primerii adaptorului 3′-RACE (a se vedea tabelul suplimentar S2 pentru secvențe). ADNc amplificat a fost detectat ca o bandă de ~ 300 bp, a se vedea Figura 2, panoul I, iar capătul 3 'al ADNc QSOX1 a fost confirmat prin secvențiere. Sfârșitul ADNc QSOX1 extins corespunde poziției 150651 a secvenței genomice (AL390718), vezi Figura 1B. De asemenea, am identificat un semnal tipic de poliadenilare AATAAA poziționat la aproximativ treizeci de nucleotide în amonte de secvența poli-A din ADNc (Figura 1B). Combinarea RT-PCR-urilor suprapuse, a 3'-RACE-PCR și a semnalului de poliadenilare a confirmat fără echivoc poziția adevăratului capăt 3 'al ADNc QSOX1. Întrucât traducerea QSOX1 se oprește în interiorul exon12 care conține un codon stop, extensia nou identificată este, prin urmare, un 3’UTR lung non-codificat.

PCR cantitativă în timp real a transcrierilor QSOX1 în cancerul de sân

Am căutat în continuare să confirmăm experimental atât existența acestei noi extensii de ARNm 3S QSOX1, cât și reglarea în sus a nivelurilor de ARNm QSOX1 în țesutul cancerului de sân. Prin urmare, PCR în timp real a fost realizat folosind seturi de sonde bazate pe secvența de codare QSOX1 (CDS) (Set 1) și pe extensia 3'UTR nou identificată (Seturile 2 și 3, vezi Figura 1A). Un panou de probe de ADNc preparate din țesut mamar îndepărtat chirurgical a fost selectat. Toate țesuturile testate au relevat transcrierea tuturor celor trei regiuni QSOX1 testate, confirmând faptul că mARN-ul QSOX1 există ca transcript de ~ 6 kbp, mult mai lung decât se credea anterior. Expresia tuturor celor trei regiuni a fost scăzută în țesuturile normale și în tumorile de gradul 1, dar a prezentat niveluri crescute într-o proporție crescândă de tumori de gradul 2 și gradul 3, Figura 3A - C. Analiza statistică non-parametrică pentru toate cele patru clasificări clinice a arătat un coeficient de corelație Spearman de 0,53 între nivelul relativ al transcrierii și gradul clinic, o valoare semnificativă la nivelul p 0,01. Dintre cele 15 tumori de gradul 3 examinate, expresia în 10 probe a depășit limita superioară a normalului (medie +2 abateri standard) pentru fiecare set de primer.