Ștergerea condiționată a feritinei H la șoareci induce pierderea depozitului de fier și afectarea ficatului - Darshan

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul elvețian pentru cercetarea experimentală a cancerului, Lausanne, Elveția

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul elvețian pentru cercetarea experimentală a cancerului, Lausanne, Elveția

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul elvețian pentru cercetarea experimentală a cancerului, Lausanne, Elveția

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul Elvețian pentru Cercetarea Experimentală a Cancerului, Facilitatea Transgenică a Șoarecilor, Lausanne, Elveția

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul Elvețian pentru Cercetarea Experimentală a Cancerului, Lausanne, Elveția

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) ISREC - Swiss Institute for Experimental Cancer Research, SV2516 - Bâtiment SV, Station 19, CH - 1015 Lausanne, Switzerland === Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul elvețian pentru cercetarea experimentală a cancerului, Lausanne, Elveția

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul elvețian pentru cercetarea experimentală a cancerului, Lausanne, Elveția

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul elvețian pentru cercetarea experimentală a cancerului, Lausanne, Elveția

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul Elvețian pentru Cercetarea Experimentală a Cancerului, Facilitatea Transgenică a Șoarecilor, Lausanne, Elveția

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Institutul elvețian pentru cercetarea experimentală a cancerului, Lausanne, Elveția

Potențialul conflict de interese: Nimic de raportat.

Abstract

Cojile de proteine de 24 de subunități de feritină H și L pot acumula până la 4500 de atomi de fier ca Fe 3+ în toate țesuturile, dar cel mai proeminent în hepatocite și celule reticuloendoteliale ale ficatului și splinei. 1 Subunitatea feritinei H are o activitate feroxidază necesară pentru depunerea fierului. 2, 3 Traducerea ambelor subunități este reglementată de proteinele de reglare a fierului 1 și 2 (IRP1 și IRP2) ca răspuns la disponibilitatea fierului. 4 Astfel, cantitatea de feritină se adaptează la nivelurile de fier ale corpului. Fierul depozitat în feritină poate fi mobilizat înainte de degradarea feritinei. Funcția de scurgere a fierului feritinei este, de asemenea, considerată a preveni cataliza mediată de fier a speciilor reactive de oxigen (ROS), care provoacă leziuni tisulare 6 și pot cauza cancer 7 și neurodegenerare. 8

Aici, am generat șoareci care transportă site-uri loxP 5 ′ din A cincea promotor de gene și 3 'de exon 1 pentru a șterge expresia feritinei H la șoareci adulți prin cre recombinază. Am șters condiționat fișierul A cincea genă la șoareci masculi adulți care utilizează Cre sub controlul promotorului genei Mx inductibil poli - IC. 23 Aceasta elimină feritina H aproape complet în ficat, măduvă osoasă, splină și timus, dar mai puțin vizibil în alte țesuturi. Raportăm aici efectele asupra depozitării fierului, toxicitatea fierului, parametrii hematologici și viabilitatea celulară. Am explorat efectele supraîncărcării cu fier înainte sau după ștergerea feritinei H și am constatat moartea rapidă a celulelor în ficat și în fibroblastele embrionare de șoarece derivate de la șoarecii noștri. În celulele cultivate, cauza morții ar putea fi atribuită ROS, depolarizarea mitocondrială și tranziția permeabilității.

Abrevieri

ALT, alanină aminotransferază; AST, aspartat aminotransferază; A cincea genă, gena feritinei H; IRP, proteină de reglare a fierului; ROS, specii reactive de oxigen; TUNNEL, transferați etichetarea dUTP nick end.

Materiale și metode

Toate procedurile experimentale sunt disponibile ca materiale și metode suport.

Rezultate

Ștergerea condiționată a feritinei H este letală în embrioni.

Pentru a studia funcția feritinei H la șoareci adulți, am generat, prin recombinarea celulelor stem embrionare, șoareci cu o alelă modificată a feritinei H denumită A cincea loxNeo . În această alelă, promotorul feritinei H și exonul 1 sunt mărginite de situsuri loxP care flancează, de asemenea, o casetă de selecție a neomicinei între situsurile FRT (Fig. 1 de susținere). Pentru a verifica strategia noastră de direcționare a feritinei H, am încrucișat A cincea loxNeo șoareci cu nestin hemizigot - șoareci Cre1. 24 Promotorul nestin prezintă un model de expresie complex cu activitate atât în creier, cât și în linia germinativă. 24 Prin urmare, se aștepta să se producă ștergerea completă a feritinei H în A cincea loxNeo/ +;Nes-Cre1 animale. Din 38 de șoareci F2, 17 (44,7%) au fost A cincea +/ + și 21 (55,3%) au fost A cincea +/ -, confirmând ștergerea indusă de nestin - Cre. Nu A cincea -/- s-au născut șoareci, indicând o funcție esențială a feritinei H în embriogeneză. Aceste rezultate sunt cel mai bine explicate printr-o ștergere a liniei germinale a feritinei H în A cincea loxNeo/ +;Nes-Cre1 F1 generația 24 cu letalitate embrionară atunci când A cincea gena este absentă din celulele germinale. 9 Acest lucru este în acord cu studiile publicate anterior cu privire la letalitatea embrionară a deleției de feritină la șoareci.

Eliminarea feritinei H la animalele adulte induce pierderea stocării fierului.

Eliminarea condiționată a feritinei H de către Mx-Cre reduce depozitarea fierului în ficat și splină. În vârstă de zece săptămâni A cincea lox/lox;Mx-Cre și control A cincea lox/lox șoarecii au fost injectați cu poli-IC pentru a activa expresia Cre. (A) În ziua 10, ștergerea feritinei H a fost evaluată în diferite țesuturi prin PCR în timp real pe ADN genomic (verde) și ADN complementar feritină H (ADNc) (albastru). Conținutul de fier țesut (roșu) a fost măsurat prin metoda batofenantrolină. Valori în A cincea Șoarecii Δ/Δ (n = 4) sunt exprimate în procente din valori în A cincea lox/lox șoareci (n = 4) stabiliți ca 100% ± deviație standard (SD). (B) Colorarea imunofluorescentă a feritinei H și L în secțiuni hepatice înghețate (ziua 10). Bară de scară = 200 μm. (C) Analiza imunoblot a feritinei H hepatice într-una A cincea lox/lox șoarecele și doi A cincea Șoareci Δ/Δ în zilele 3 și 10. (D) Secțiuni de splină înghețate colorate de albastru prusian al lui Perl în ziua 30. Bară de scară = 200 μm. (E) Secțiuni de splină înghețate colorate pentru macrofage cu anticorpi anti-CD11b și anti-F4/80, precum și 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Bară de scară = 100 μm.