Semnalizare translațională, expresie genică atrogenă și miogenică în timpul descărcării și reîncărcării
Heather K. Smith
1 Departamentul Sport și Știința Exercițiului, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă,
Kenneth G. Matthews
2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,
Jenny M. Oldham
2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,
Ferenc Jeanplong
2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,
Shelley J. Falconer
2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,
James J. Bass
3 Institutul Liggins, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă,
Mônica Senna-Salerno
2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,
Jeremy W. Bracegirdle
2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,
Christopher D. McMahon
2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,
Conceput și proiectat experimentele: CDM HKS KGM JMO FJ JJB. Au efectuat experimentele: KGM CDM JMO SJF MSS JWB. Am analizat datele: CDM HKS JMO SJF JWB. Am scris lucrarea: CDM HKS FJ KGM.
Abstract
Analizele Western Blot
O probă de 150 mg de mușchi gastrocnemius lateral a fost omogenizată în 1 ml tampon de liză (10 mM Hepes, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl, pH 7,9) cu 0,5% detergent IGEPAL (Sigma, MO, SUA) și un inhibitor enzimatic (complet, Roche Diagnostics). Probele au fost omogenizate pe gheață, apoi centrifugate la 11.000 × g timp de 10 minute. Supernatantul a fost recuperat, amestecat cu tamponul de încărcare Laemmli [55], fiert timp de 5 minute, apoi depozitat la –20 ° C până la analiză. Concentrația de proteine a supernatantului a fost determinată utilizând testul acidului bicinchoninic (Sigma-Aldrich NZ, Auckland, NZ).
m 7 GTP-sepharose Cromatografie
Pentru a verifica dacă starea de fosforilare a 4E-BP1 reflectă legarea la eIF4E, am folosit rășină m7 GTP-sepharose 4B pentru a izola și a evalua starea legată a acestor proteine pentru o comparație încărcată (ziua 0) și descărcată (ziua 2) ca anterior descris [56], [57]. Pe scurt, rășina m7 GTP-sepharose 4B (GE Healthcare Ltd, Auckland, NZ), a fost spălată de două ori cu tampon de liză (descris mai sus) și 80 μl de suspensie de 50% a fost amestecat cu 300 μg de supernatant din mușchiul gastrocnemius omogenizat și se lasă să se incubeze peste noapte la 4 ° C. După centrifugare la 13.000 × g și trei spălări în 1 ml tampon de liză, materialul legat a fost resuspendat într-un volum egal de 2x tampon de încărcare Laemmli. Western blot a fost efectuată prin încărcarea a 30 μl de probă pe geluri SDS-PAGE de 10% (eIF4E) sau 15% (4E-BP1). Membranele au fost blocate așa cum s-a descris anterior și 4E-BP1 a fost detectat prin incubarea cu anticorp anti-iepure anti-4E-BP1 (112000, Cell Signaling Technology Inc), în timp ce eIF4E a fost detectat prin incubare cu anticorp monoclonal anti-eIF4E de șoarece (1∶2000, # sc9976, Santa Cruz Biotechnology Inc) peste noapte. Detectarea a fost cea descrisă mai devreme.
Evaluarea izoformelor cu lanț greu de miozină
Dimensiunea fibrei musculare
Analize statistice
Masa umedă a mușchilor a fost exprimată în raport cu masa corporală inițială pe d0. Datele au fost supuse analizei varianței folosind GenStat versiunea 13 (VSN International Ltd) cu factori de genotip (Mstn (-/-) sau de tip sălbatic), ziua și interacțiunea lor incluse în declarația modelului. Comparații multiple post-hoc au fost efectuate folosind metoda lui Tukey [61]. Datele sunt prezentate ca mijloace și eroarea standard a mediei (sem).
Rezultate
Șoarecii din ambele genotipuri au pierdut masa corporală în timpul HS și au recuperat masa corporală în măsuri similare în timpul reîncărcării (P Figura 1). Toți mușchii recoltați de la șoareci Mstn (-/-) au pierdut masă musculară în timpul HS, în timp ce numai soleusul șoarecilor de tip sălbatic a pierdut masă în timpul HS. Masa musculară pierdută de la șoarecii Mstn (-/-) a fost în mare parte restabilită după 7 zile de reîncărcare. Cu toate acestea, masa mușchilor B. femoris și Quad a Mstn (-/-) nu a fost recuperată complet prin reîncărcarea d7 (Figura 2). Pierderea relativă (~ 20%, P Figura 2).