Restricția calorică pe termen scurt îmbunătățește repararea ADN-ului prin îmbinarea finală neomologă la șoareci npj Îmbătrânire
Subiecte
Abstract
Restricția calorică (CR) îmbunătățește sănătatea, reduce incidența cancerului și extinde durata de viață în mai multe organisme, inclusiv șoareci. S-a arătat că CR îmbunătățește reparația exciziei de bază și căile de reparare a exciziei de nucleotide ale reparării ADN-ului, totuși, dacă CR îmbunătățește repararea rupturilor de ADN dublu catenar nu a fost examinat într-un sistem in vivo. Aici utilizăm șoareci reporteri non-omologi de îmbinare finală (NHEJ) pentru a arăta că CR pe termen scurt îmbunătățește puternic repararea ADN-ului de către NHEJ, care este asociat cu niveluri ridicate de ADN-PK și SIRT6.
Am generat un șoarece reporter knock-in care permite măsurarea cantitativă a eficienței NHEJ in vivo folosind endonucleaza I-SceI pentru a induce pauze ADN-ADN specifice site-ului în caseta reporter NHEJ integrată în ROSA26 locus 19 (Fig. 1a). Caseta reporter NHEJ 19 constă din gena GFP întreruptă de intronul Pem1 de șobolan, care nu are omologie cu genomul șoarecelui și un exon „ucigaș” flancat de situsuri I-SceI. GFP este inactivat de prezența exonului ucigaș într-o construcție neamenajată. Tăierile I-SceI duc la eliberarea exonului ucigaș, în timp ce repararea cu succes a NHEJ re-ligează intronul ducând la reactivarea genei GFP. Evenimentele de reparare NHEJ care apar în cadrul intronului tolerează ștergerile (până la 1 kb pe fiecare parte a tăieturii) și inserțiile fără a interfera cu activitatea GFP.
Modelul de șoarece reporter NHEJ oferă un nou instrument pentru a studia efectul CR asupra eficienței NHEJ in vivo. Rapoartele anterioare nu au examinat efectul CR pe termen scurt asupra NHEJ. În special, s-a raportat că 4 săptămâni de CR sunt suficiente pentru ameliorarea modificărilor legate de vârstă ale metilomului ADN 20, sugerând că CR pe termen scurt poate fi suficient pentru a spori eficiența reparării ADN-ului. În acest raport, am folosit șoareci reporteri NHEJ pentru a examina efectul pe termen scurt de 40% CR asupra eficienței NHEJ. Am constatat că eficiența NHEJ a fost mult îmbunătățită prin CR pe termen scurt.
Pentru a calcula consumul zilnic de calorii la șoarecii reporteri NHEJ, am hrănit șoareci ad libitum cu o dietă de pelete de precizie fără praf și am numărat numărul de pelete consumate. Șoarecii au consumat în medie 14,3 ± 1,3 kcal pe zi sub hrănire ad libitum și și-au menținut greutatea corporală (Fig. 1b). În grupul CR, șoarecii au fost hrăniți cu 8,4 kcal/zi, ceea ce a fost egal cu 60% din consumul mediu zilnic de calorii. Șoarecii CR au pierdut greutatea corporală în primele două săptămâni de hrănire și apoi și-au menținut greutatea corporală (Fig. 1c). Toți șoarecii erau găzduiți singuri pentru a asigura un consum egal de alimente. Șoarecii au fost sacrificați la 4 săptămâni de la începutul dietei. NHEJ a fost măsurat în celule primare izolate de piele proaspătă, plămâni, rinichi și creier de șoareci. Testul NHEJ a fost efectuat așa cum s-a descris anterior 19. Pe scurt, celulele au fost co-transfectate cu o plasmidă care codifică enzima I-SceI pentru a induce DSB-urile și o plasmidă DsRed pentru a se normaliza pentru eficiența transfecției și au fost analizate prin citometrie în flux. Eficiența NHEJ a fost calculată ca un raport dintre celulele GFP + și celulele DsRed +. SceI, NHEJ-GFP și DsRed sunt exprimate de la un promotor CMV. Important, CR nu a modificat intensitatea fluorescenței DsRed (suplimentar Fig. 1c), sugerând că expresia I-SceI nu a fost afectată de CR.
Am constatat că CR pe termen scurt a crescut semnificativ eficiența NHEJ la nivelul pielii, plămânilor, rinichilor și țesuturilor cerebrale, comparativ cu șoarecii hrăniți ad libitum din piele, plămâni, rinichi și creier (Fig. 1d). Această creștere a fost asociată cu niveluri crescute de ADN PK (Fig. 1e, f) și SIRT6 (Fig. 1e, g). Aceste rezultate indică faptul că CR pe termen scurt este suficient pentru a spori NHEJ.
Ștergerile foarte mari se pot extinde în regiunea de codificare GFP și pot duce la pierderea semnalului. Deși, teoretic, un tratament CR poate modifica fidelitatea reparării, din studiile noastre anterioare de secvențiere la animale AL din aceeași tulpină, delețiile se extind foarte rar în regiunea codificatoare a genei GFP 19. Prin urmare, modificarea observată a eficienței NHEJ nu poate fi explicată prin fidelitatea modificată a NHEJ.
Studiile anterioare au arătat că CR a împiedicat scăderea legată de vârstă a capacității de reparare 17.18, în timp ce aici arătăm că CR pe termen scurt îmbunătățește NHEJ la animalele tinere. Acest CR pe termen scurt, sau poate postul intermitent, poate oferi un plus de beneficii. Stresul de mediu conferit de CR poate declanșa răspunsul hormetic prin activarea căilor de răspuns la stres, cum ar fi SIRT6 și reglarea în sus a mașinilor de reparare a ADN-ului. Eficiența îmbunătățită a NHEJ va avea ca rezultat niveluri mai scăzute de deteriorare persistentă a ADN-ului, reducerea morții celulare, îmbunătățirea stabilității genomului și reducerea sarcinii mutaționale. Această stabilitate îmbunătățită a genomului va contribui probabil la scăderea incidenței cancerului și la o durată de viață mai lungă conferită de CR. Constatarea noastră că chiar și un CR pe termen scurt este suficient pentru a declanșa aceste efecte benefice este important pentru aplicațiile practice ale CR la om, unde CR pe termen lung este dificil de realizat, în timp ce CR pe termen scurt sau postul intermitent este mai fezabil.
Metode
Animale
Toate experimentele la șoarece au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare stabilite de Comitetul pentru Resurse Animale al Universității din Rochester. Șoarecii masculi au fost utilizați în acest studiu și au fost toți într-o singură carcasă pentru a efectua experimente de hrănire controlată de calorii. Experimentele au fost efectuate pe șoareci C57BL/6 în vârstă de 3-5 luni care adăposteau caseta reporter NHEJ în locusul ROSA26 generat de Vaidya și colab. 19 .