Restricția calorică crește biogeneza mitocondrială musculară la oamenii sănătoși

* Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: [email protected]

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Anthony E Civitarese,
Stacy Carling,
Leonie K Heilbronn,
Mathew H Hulver,
Barbara Ukropcova,
Walter A Deutsch,
Steven R Smith,
Eric Ravussin

Cifre

Abstract

fundal

Restricția calorică fără malnutriție extinde durata de viață într-o serie de organisme, inclusiv insecte și mamifere și scade producția de radicali liberi de către mitocondrii. Cu toate acestea, mecanismul responsabil pentru această adaptare este slab înțeles.

Metode și constatări

Analiza biochimică

Grăsimea corporală a fost măsurată prin absorptiometrie cu raze X cu energie dublă (QDA 4500A, Hologics, http://www.hologic.com). Nivelul insulinei serice și al tri-iodotironinei (T3) au fost măsurate folosind teste imuno-testate (DPC 2000, Diagnostic Products Corporation, http://www.dpc.com). Glucoza plasmatică a fost analizată folosind un electrod de glucoză oxidază (Synchron CX7, Beckman, http://www.beckmancoulter.com), în timp ce adiponectina a fost determinată folosind ELISA non-radioactiv (Linco, http://www.lincoresearch.com).

ARNm cuantificarea expresiei genei

Probele de biopsie Vastus lateralis (

150 mg) au fost luate după anestezie locală utilizând tehnica Bergstrom [19]. Grăsimea și țesutul conjunctiv au fost îndepărtate din proba de biopsie, iar mușchii au fost înghețați în azot lichid și depozitați la -80 ° C până la finalizarea studiului. ARN-ul a fost izolat din aproximativ 30 mg de țesut utilizând metoda acid fenol și purificat cu coloane RNeasy (Qiagen, http://www.qiagen.com). ADN-ul a fost extras din aceleași probe de țesut, după degradarea proteinei și ARN-ului cu Trizol, prin extracție cu fenol-cloroform și precipitare cu etanol conform procedurii producătorului (Invitrogen, http://www.invitrogen.com). Amorsele și sondele (Tabelul S1) au fost proiectate folosind Beacon Designer V2.1 (Bio-Rad, http://www.bio-rad.com). Reacțiile qRT (în timp real cantitativ) -PCR au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [20]. Toate datele de expresie au fost normalizate prin divizarea genei țintă de RPLPO sau peptidilprolil izomeraza B (PPIB) mARN (care codifică ciclofilina B).

PCR în timp real pentru ADN mitocondrial

Cantitățile relative de ADN nuclear și ADN mitocondrial (ADNmt) au fost determinate prin qRT-PCR așa cum s-a descris anterior [21]. Raportul dintre ADNmt și ADN nuclear reflectă concentrația țesutului de mitocondrii per celulă.

Activități ale enzimelor mitocondriale ale mușchilor scheletici

Activitatea enzimei antioxidante

Lizatele celulare au fost preparate prin sonicare în tampon rece 20 mM HEPES (pH 7,2), conținând EDTA 1 mM, 210 mM manitol și 70 mM zaharoză și centrifugate la 1.500 g timp de 5 minute la 4 ° C. Activitatea totală superoxid dismutază (SOD) (Cu/Zn-, Mn- și Fe-SOD) a fost cantitativă prin măsurarea dismutației radicalilor superoxid generați de xantină oxidază. Activitatea enzimatică a fost determinată de o analiză indirectă, în conformitate cu kitul de analiză Cayman Chemicals disponibil comercial (http://www.caymanchem.com).

Potențialul membranei mitocondriale și masa mitocondrială

Măsurarea potențialului membrană mitocondrială ester etilic al tetrametilrodaminei (TMRE; Molecular Probes, http://probes.invitrogen.com) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [22]. Pentru cuantificarea masei mitocondriale am folosit sonda Mitotracker Green (Molecular Probes). Sonda Mitotracker Green se acumulează preferențial în mitocondrii, indiferent de potențialul membranei mitocondriale și oferă o evaluare exactă a masei mitocondriale. Celulele au fost spălate cu PBS și incubate la 37 ° C timp de 30 de minute cu 100 nM MitoTracker Green FM (Molecular Probes). Celulele au fost recoltate folosind tripsină/EDTA și resuspendate în PBS. Intensitatea fluorescenței a fost detectată cu lungimi de undă de excitație și emisie de 490 și respectiv 516 nm și valorile corectate pentru proteina totală (mg/ml).

Cultura celulelor musculare scheletice

Biopsii musculare Vastus lateralis (

100 mg) au fost obținute de la cinci indivizi sănătoși, cu greutate normală, tineri, sedentari (indice de masă corporală = 24,1 ± 0,5 kg/m 2; grăsime corporală = 15% ± 1%; concentrație de glucoză în repaus alimentar = 88 ± 2 mg/dl; insulină plasmatică în repaus alimentar = 4,4 ± 0,9 μU/ml). Celulele satelit au fost izolate așa cum s-a descris anterior [23]. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 12 godeuri (ARN/ADN) și șase godeuri (proteină) la o densitate de 20 × 103 celule/cm2. Celulele au fost cultivate la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Două perechi de ARN-uri interferente mici (si) au fost sintetizate chimic (Invitrogen), recocite și transfectate (200 pmol/ml) în miocite umane primare confluente 50% -70% folosind reactivi de transfecție GeneSilencer siRNA (Gene Therapy Systems, http: //www.genetherapysystems.com). Secvențele siARN-urilor de sens sunt după cum urmează; AdipoR1, 5'-AAACAGCACGAAACCAAGCAGAUGG-3 '; AdipoR2, 5′-AUGUCCCACUGGGAGACUAUAAUGG-3 ′. Celulele transfectate cu siRNA (simulat) ne-funcțional (Ambion, http://www.ambion.com) au fost utilizate ca martori negativi (date nepublicate). Diferențierea mioblastelor în miotuburi a fost inițiată așa cum s-a descris anterior [23]. La 72 de ore după inducerea diferențierii, mediul a fost schimbat și tratat fie cu adiponectină globulară de mamifer timp de 48 de ore (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA), fie cu un donator de oxid nitric - 50 μM de 2,2 ′ - (hidroxinitrosohidrazono) bis- etanimină (DETA-NU) (Sigma, http://www.sigmaaldrich.com) - o dată pe zi timp de 4 zile [7,24].

Metode statistice

Datele sunt exprimate ca medii ± erori standard ale mediei. Analiza datelor a fost efectuată folosind SAS v. 9.1 (http://www.sas.com). Modificările de la momentul inițial la luna a 6-a au fost analizate prin analiza covarianței cu tratament și interacțiuni în timp și valoarea inițială inclusă ca covariantă. În experimentele de cultură celulară, s-au folosit teste t pentru a determina efectul tratamentului. Corelațiile Pearson sau Spearman au fost utilizate acolo unde a fost cazul. Datele au fost considerate semnificative dacă p Tabelul 1.