Reglarea insulinei a mușchilor scheletici PDK4 Expresia mARN-ului este afectată de insulina acută rezistentă

Abstract

Analiza Northern blot pentru nivelurile de ARNm PDK2 și PDK4.

Extracția ARN și analiza Northern blot au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (10). Pe scurt, ARN-ul total a fost extras din mușchii înghețați folosind Tri Reagent de la Centrul de Cercetare Moleculară (Cincinnati, OH) conform instrucțiunilor producătorului. Electroforeza a fost efectuată folosind 25 μg fiecare din preparatele totale de ARN într-un gel de denaturare de 1%. ARN-ul a fost apoi transferat capilar pe o membrană de nylon cu încărcare pozitivă (BrightStar-Plus; Ambion, Austin, TX). Sondele ADNc pentru PDK2 și PDK4 de șobolan au fost obținute prin RT-PCR utilizând un kit Advantage One Step RT-PCR de la Clontech (Palo Alto, CA) și următoarele exemple: PDK-4, 5′-CGTCGCCAGAATTAAAGCTC și 3′-CTGCCAGTTCTCTCTCTGAC și PDK -2, 5′-GTCAGCTAGGGGCCTTCTCT și 3′-CAGGACTATGCAGGCAGTGA. Sondele ADNc au fost marcate cu [32 P] dCTP (Perkin Elmer) folosind un kit de marcare ADN DECAprime (Ambion). Hibridizarea a fost efectuată la 42 ° C în soluție Ultrahyb (Ambion). Densitățile relative din autoradiografii au fost cuantificate folosind Bio-Rad Molecular Analyst. Pentru a controla încărcarea ARN, toate pete au fost cuantificate pentru gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază prin utilizarea unei sonde incluse în kitul de etichetare ADN DECAprime (Ambion).

insulinei

Analiza Western blot pentru nivelurile de proteine ​​totale și fosforilate ale Akt și FOXO1.

Alte teste.

Glucoza plasmatică a fost analizată printr-o metodă de glucoză oxidază pe un Beckman Glucose Analyzer II (Beckman, Fullerton, CA). Insulina plasmatică a fost măsurată prin radioimunotest folosind un kit de la Linco Research (St. Charles, MO). FFA-urile plasmatice au fost măsurate folosind un kit colorimetric pe bază de acil-CoA oxidază (Wako Chemicals, Richmond, VA). Lactatul plasmatic a fost măsurat printr-o metodă lactat oxidază pe un analizor de lactat YSI (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH).

analize statistice.

Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. Semnificația diferențelor în valorile medii între diferitele grupuri de tratament a fost evaluată utilizând ANOVA unidirecțional, urmată de o analiză ad hoc folosind testul Tukey. Corelația Pearson a fost utilizată pentru a evalua corelația univariată. P 2 mmol/l (P 0,05). În plus, nivelul de ARNm PDK2 nu a fost modificat de perfuzia finală de insulină de 5 ore în toate cele trei grupuri de perfuzie (cu soluție salină, Intralipid și lactat) (P> 0,05). În schimb, nivelurile de mARN ale PDK4 au fost suprimate de insulină cu> 80% în grupul martor salin (discuție P). Rezultate similare au fost obținute la nivelul mușchiului solei (Fig. 3), care conține în principal fibre oxidative cu mișcare lentă (versus fibre cu mișcare rapidă în mușchiul gastrocnemius), sugerând că efectul insulinei asupra expresiei mARN-ului PDK4 și modificarea acestuia în stările rezistente la insulină sunt independent de tipul fibrei musculare.

Studiul nostru anterior (10) a demonstrat că o perfuzie de insulină de 5 ore a avut un efect profund (~ 72%) pentru scăderea nivelului de ARNm PDK4, dar efectul insulinei a fost doar modest (~ 21%) la nivelul proteinelor, sugerând că 5- h perioada de perfuzie cu insulină nu a fost un timp suficient pentru ca transcrierea scăzută a PDK4 să se reflecte pe deplin în nivelul proteinelor. În studiul de față, nu am determinat nivelul proteinei PDK4, deoarece detectarea unei modificări a efectului mic al insulinei asupra nivelului de proteină PDK4 ar fi practic imposibil sau ar necesita altfel un număr mare de experimente.