Provizionarea aminoacizilor esențiali simbiotici în gândacul american, Periplaneta americana

Paul A. Ayayee

1 Departamentul de Evoluție, Ecologie și Biologie Organismală, Universitatea de Stat din Ohio, SUA

Thomas Larsen

2 Laborator pentru întâlniri radiometrice și cercetarea izotopilor stabili, Christian-Albrechts-Universität Kiel, Kiel, Germania

Zakee Sabree

1 Departamentul de Evoluție, Ecologie și Biologie Organismală, Universitatea de Stat din Ohio, SUA

Date asociate

Următoarele informații au fost furnizate cu privire la disponibilitatea datelor:

Datele brute au fost furnizate ca informații suplimentare.

Abstract

Introducere

Insectele care persistă în diete limitate în substanțe nutritive esențiale sunt considerate a se baza pe simbioza mutualistă (obligatorie sau facultativă) cu microbi pentru a dobândi acești nutrienți și pentru a îndeplini cerințele de creștere, fecunditate, longevitate și, în cele din urmă, fitness (Douglas, 2009). Dovezi ale aprovizionării cu nutrienți endosimbionți obligați și influența acestora asupra stării de sănătate a gazdei au fost demonstrate în mai multe sisteme endosimbionale obligate de insecte, cum ar fi afidul de mazăre-Buchnera (Prosser și Douglas, 1991; Douglas, Minto și Wilkinson, 2001; Russell și colab. ., 2014), și tsetse fly-Wigglesworthia (Pais și colab., 2008). Cu toate acestea, diversitatea speciilor microbiene și complexitatea interacțiunilor interspecifice din intestinele gazdelor de insecte fac ca determinarea contribuțiilor și funcțiilor microbiotei asociate intestinului să fie o provocare. Această dificultate este în continuare agravată de variații considerabile ale compoziției comunității cu timpul și etapele de dezvoltare ale gazdei, precum și de diferențele în cerințele fizico-chimice (oxigen și pH) necesare membrilor comunității pentru a îndeplini anumite funcții (Engel și Moran, 2013).

A doua premisă este că bacteriile și ciupercile generează semnături distincte δ 13 CEAA (Larsen și colab., 2009). Prin urmare, este posibil să se determine dacă intrarea EAA nedietetică/simbiotică este de origine bacteriană sau fungică. Acest lucru se realizează într-un cadru de model predictiv utilizând microbian (bacterian și fungic) și dietetic δ 13 CEAA ca clasificatori pentru a determina apartenența la grup a gândacului δ 13 CEAA. Această abordare, numită tehnica de amprentă 13 C, a fost utilizată pentru a determina originile biosintetice ale EAA în mai multe sisteme (Larsen și colab., 2009; Larsen și colab., 2011; Larsen și colab., 2013; Vokhshoori, McCarthy și Larsen, 2014; Ayayee, Jones & Sabree, 2015; Ayayee și colab., 2015). Am emis ipoteza că aprovizionarea cu EAA microbiană va fi mai mare la gândacii hrăniți cu o dietă săracă în proteine față de cei hrăniți cu o dietă bogată în proteine. Acest lucru ar fi ilustrat ca compensări izotopice mai mari între gandacii hrăniți cu o dietă săracă în proteine și dieta lor, precum și un număr mai mare de gandaci hrăniți cu o dietă scăzută în proteine atribuite clasificatorilor microbieni (bacterii sau ciuperci) în modelul predictiv.

Metode și materiale

Sursa insectelor

Nimfele P. americana de 5 stele utilizate în acest studiu au fost obținute dintr-o colonie menținută în insectarul Departamentului de Evoluție, Ecologie și Biologie Organismală, de la Universitatea de Stat din Ohio, Columbus, Ohio. Dificultăți considerabile asociate cu eliminarea cu încredere a Blattabacterium din corpurile de grăsime a gândacului au necesitat decizia de a folosi gândaci de comoditate și disponibilitate infectați cu Blattabacterium. Înainte de experimentare, insectele erau menținute într-o cameră de creștere (27 ° C și 29% umiditate relativă) și hrănite cu pelete de hrană pentru câini (27% proteine brute).

Experimente dietetice

pregătirea unei mostre

δ 13 cuantificare și analiză CEAA

Toate probele au fost hidrolizate cu acid și derivatizate într-o soluție de metanol, piridină și cloroformiat de metil utilizând o metodă de derivatizare rapidă într-un singur pas (Walsh, He & Yarnes, 2014; Chen și colab., 2010). Aproximativ 0,35 pl alicote de probe derivatizate au fost apoi injectate într-o căptușeală fără împărțire la 250 ° C cu un debit de heliu de 2,8 ml/min. Condițiile și optimizarea în timpul derivatizării și analizei au fost efectuate așa cum s-a raportat anterior (Chen și colab., 2010; Walsh, He & Yarnes, 2014). Analizele au fost efectuate folosind un cromatograf cu gaze de urmărire (Thermo Fisher Scientific) cuplat la un spectrometru de masă al raportului izotopului Delta V Advantage prin GC Combustion Interface III (Thermo Electron, Bremen, Germania) folosind coloana VF-23ms cu polaritate înaltă (Agilent Technologies) . Temperaturile cuptorului de ardere și reducere au fost de 950 ° C, respectiv 650 ° C.

δ 13 CEAA, definit ca eșantion R EAA ∕ R standard EAA - 1 × 1, 000 ‰, unde R este raportul dintre izotopul greu și ușor în EAA al eșantionului, Rsample EAA și standard, Rstandard EAA, a fost stabilit pentru fiecare eșantion și calibrat la standardul internațional δ 13 C, scara Vienna Pee Dee Belemnite (V-PDB) (Coleman & Fry, 1991). Au fost analizate două replici tehnice pe eșantion biologic. Corecția pentru adăugarea de carbon în timpul derivatizării a fost efectuată după analiză (Walsh, He & Yarnes, 2014; Chen și colab., 2010). Au fost obținute vârfuri distincte fără suprapuneri pentru izoleucina, leucina, valina, fenilalanina și lizina EAA din coloana capilară a cromatografului gazos pentru toate probele. S-au obținut valorile corectate cu carbon δ 13 CEAA ale leucinei (Leu), izoleucinei (Ile), lizinei (Lys), fenilalaninei (Phe) și valinei (Val).

Analize statistice

Analiza modelului mixt și separările medii (Student's t-test, P = 0,05) au fost efectuate pentru datele LQD și DF δ 13 CEAA folosind JMP 10 (SAS Inc. NC, SUA). Compensări individuale Δ 13 C între cele 5 EAA pentru gandac și probe dietetice au fost determinate ca: Δ 13 CEAA = δ 13 CCockroachEAA - δ 13 CDiet EAA. Grupurile erau; dietă de calitate scăzută (LQD), anexe de roach hrănite cu LQD, filtrat intestinal de hrănire LQD, hrană pentru câini (DF), anexe de hrănire DF și filtrat de gut.

Am utilizat o analiză funcțională discriminantă liniară (LDA) folosind training 13 date de formare CEAA din probe de referință bacteriene și fungice (Larsen și colab., 2013) și probele dietetice LQD și DF pentru a genera modelul predictiv. Datele δ 13 CEAA obținute de la ciuperca Fusarium solani (n = 2), utilizate într-un studiu anterior și analizate din aceeași instalație ca aceste probe, au fost incluse în model pentru validare (Ayayee și colab., 2015). Clasificarea probei de ciuperci cunoscute și apartenența la grup a probelor de gândaci în raport cu clasificatorii a fost determinată folosind pachetul R MASS (Venables & Ripley, 2002).

Rezultate

Δ 13 compensări C detectate între gândaci alimentați cu LQD și DF și dietele respective

Un efect general semnificativ al modelului a fost determinat atât pentru probele de gândac hrănite cu DF, cât și pentru cele cu LQD și dietele respective (F (29.160) = 110, P 13 CEAA au fost detectate în toate grupurile din toate cele 5 EAA măsurate (F (5.184) = 263, P Tabelul 1). Medie pozitivă Δ 13 C-offset pentru apendicele de roach alimentat cu DF și probele de filtrat intestinal alimentat cu DF au fost, respectiv, 1,30 ± 0,18 ‰ și 1,4 ± 0,18 ‰ (medie ± se) față de dieta DF (0 ‰), în timp ce media Δ 13 C -depărtarea dintre anexele de roach hrănite cu LQD și probele de filtrat intestinal de hrănire LQD au fost respectiv 7,8 ± 0,2 ‰ și 4,6 ± 0,2 ‰ (medie ± se), în raport cu dieta LQD (0 ‰) (Tabelul 1). Au fost, de asemenea, determinate diferențe semnificative în A 13 CEAA din cele 5 EAA măsurate (F (4.185) = 411, compensări P 13 C între probele de gândac hrănite cu DF și LQD și dietele respective pentru fiecare dintre cele 5 EAA sunt prezentate în Fig. 1. Atât pentru probele de gândac hrănite cu DF, cât și pentru cele cu LQD, compensările au fost cele mai mari pentru lizină și valină (adică îmbogățite cu 13 C), urmate de leucină, izoleucină și fenilalanină. În general, gradul de Δ 13 C -offsetul izotopic a fost mai mare în probele de gândac hrănite cu LQD (6,2 ± 0,2 ‰, medie ± se), comparativ cu probele de gândac hrănite cu DF (1,35 ± 0,18 ‰, medie ± se) (Fig. 1). Datele CEAA utilizate în analize sunt prezentate în Tabelul S1.