Profil ARN extracelular în limfă mezenterică din modele exemplare de șobolani acută și critică

Adresa corespondenței către: Jiwon Hong, dr., Chirurgie aplicată și Laborator de metabolizare, Școala de Științe Biologice, Universitatea din Auckland, 3A Symonds Street, Private Bag 92019, Auckland 1142, Noua Zeelandă

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Departamentul de Medicină Moleculară și Patologie, Facultatea de Medicină și Științe ale Sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Abstract

Fundal: Limfa mezenterică (ML) a fost implicată în dezvoltarea sindromului de disfuncție a mai multor organe în bolile critice. ARN-urile extracelulare joacă un rol în comunicarea celulă-celulă în timpul proceselor fiziologice și de boală, dar sunt rareori studiate în ML. Am urmărit examinarea profilurilor de ARN ale plasmei periferice, ML și vezicii extracelulare ale ML (ML-EV) și fracțiunilor lipoproteinei bogate în trigliceride (ML-TRL), obținute din modele de rozătoare ale bolii critice.

Metode și rezultate: Am colectat ML timp de 5 ore de la modele de rozătoare ale bolilor critice [pancreatită acută, legare și incizie cecală (CLI), ischemie-reperfuzie intestinală (IR)] și șobolani de control Sham. Fracțiile ML-EV și ML-TRL au fost, de asemenea, izolate. Secvențierea ARN a fost efectuată pe ARN extras din ML, ML-EV, ML-TRL și plasmă utilizând platforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Secvențele de ARN au fost căutate folosind Instrumentul de căutare a alinierii locale de bază împotriva genomului șobolanului și a bazelor de date RefSeq, microARN (miARN), ARNm genomic, ARN funcțional și Genbank, și au fost analizate numărul de citiri. Fiecare tip de probă a avut un profil distinct de ARN. ML conținea mai mult ARN pe volum și o proporție mai mare de fragmente de ARNt decât plasma. ML-EV-urile au fost îmbogățite cu miARN, în timp ce ML-TRL-urile conțineau cantități absolute scăzute de ARN. Profilurile de dimensiune ARN pentru CLI și Gut IR au fost diferite de Sham. ML a purtat ARN-uri intestinale și într-un model CLI a fost îmbogățit semnificativ cu secvențe de ARN bacteriene.

Concluzii: Am găsit profilurile de ARN distincte, dar diverse ale ML și compartimentele sale, precum și profilurile lor diferite în bolile critice. ARN-urile mici derivate din intestin în ML pot avea un rol direct în boli critice și utilitate ca potențiali biomarkeri.

Introducere

Diverse specii de ARN de reglementare 1 sunt stabile în afara celulei 2 și joacă roluri în comunicarea celulă-celulă 3 și alte procese biologice sau patologice. 2,3 Astfel de ARN-uri extracelulare, 1 cu cele mai studiate fiind microARN (miARN), 2,3 au fost găsite într-o varietate de biofluide, 4,5 unde pot fi ambalate cu vezicule extracelulare (EV), 6 lipoproteine, 7 și alte complexe ribonucleoproteice. 3

Sistemul limfatic este o rețea organizată de țesut limfoid; transportă lichid tisular/celule limfatice și limfoide, 8 și diferite afecțiuni patologice, cum ar fi inflamația, cancerul și infecția, pot provoca modificări ale funcției limfatice. 9 Limfa mezenterică (ML) se scurge continuu din intestin și reintră în circulație la vena subclaviană chiar înainte de inimă și plămâni. ML urmează o cale anatomică directă între intestin și fluxul sanguin periferic fără a trece prin ficat. În sănătate, ML este esențial în homeostazia fluidelor și absorbția lipidelor din dietă. Lipoproteinele bogate în trigliceride (TRL) sunt lipoproteinele majore din ML care transportă lipidele intestinale în sânge. În boală, ML apare ca un factor important10 și a fost implicat în dezvoltarea sindromului disfuncției organelor multiple în boala critică. 10 Deși miARN-urile au fost detectate în pancreatita ML a modelului de rozătoare și pacienții care utilizează abordări microarray, alți 11 ARN extracelulari sau alte tipuri de boli critice sunt încă de studiat.

Aici, am examinat micile profiluri de ARN ale plasmei și ML colectate de la diferite modele de rozătoare ale bolilor critice [pancreatită acută, legare și incizie cecală (CLI), ischemie-reperfuzie intestinală (IR)] pentru prima dată utilizând secvențierea Ion Torrent.

Materiale și metode

Consultați Date suplimentare pentru detalii complete. Pe scurt, pancreatita acută, CLI și IR intestinale au fost induse la șobolanii masculi adulți Sprague-Dawley. Șobolanii de control Sham au suferit aceeași intervenție, dar fără inducerea bolii. Pentru modelele de drenaj, conducta ML superioară a fost canulată pentru a colecta ML continuu pe gheață timp de 5 ore de la șobolani. O probă de plasmă periferică a fost colectată de la toți șobolanii studiați la un moment dat la finalizarea colectării limfei de 5 ore. Pentru CLI și Gut IR, fracțiile îmbogățite cu EV și TRL au fost izolate din ML (ML-EV; ML-TRL) utilizând soluția de precipitare exosomică Macherey-Nagel și respectiv ultracentrifugarea diferențială. Secvențierea ARN-ului mic a fost efectuată pe ARN extras din probe de plasmă grupate ( = 3), ML = 3), ML-EV = 4) și ML-TRL = 5) pe platforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Secvențele de ARN au fost filtrate și căutate utilizând Instrumentul de căutare a alinierii locale de bază (BLAST) împotriva diferitelor baze de date, inclusiv genomul șobolanului și bazele de date RefSeq, miARN, ARNm genomic, ARN funcțional și Genbank. Secvențele de ARN au fost clasificate, iar numărul de citiri au fost analizate.

Rezultate si discutii

Au existat diferențe distincte în profilurile ARN între ML și plasmă. Recent, diferențele în compoziția mică de ARN între 12 biofluide umane au fost caracterizate de Godoy și colab., 5 dar ML nu a fost investigat. ML conținea mai mult ARN pe volum decât plasma, atât cu intrarea totală, cât și cu numărul de citiri potrivite cu BLAST fiind> de 20 de ori mai mare (Fig. 1A; Tabel suplimentar S1). Deși> 90% din citirile utilizabile atât în ML cât și în plasmă au fost identificate ca fiind de origine „șobolan”, subtipurile lor de ARN au apărut în proporții diferite (Fig. 1B). Cea mai notabilă diferență a fost în proporția de ARNt:> 90% au apărut în ML față de ~ 45% în plasmă pentru șobolanii Sham, majoritatea fiind jumătăți de ARNt (~ 32 nt; jumătate din ARNt de lungime completă). Dintre diferitele jumătăți de ARNt, cea mai abundentă jumătate de ARNt detectată în acest studiu a fost una derivată din capătul 5 ′ al Gly-GCC (ARNt cu anticodon GCC recunoaște codonul GCC, care codifică glicina): media 48% din ARNt total de șobolan în ML și 69% în plasma șobolanilor Sham (Fig. 1C). Suprareprezentarea fragmentelor de ARNt ar putea fi un artefact al metodelor convenționale de secvențiere a ARN-ului, 12-14, dar alte studii 15,16 au arătat că diferite condiții de stres pot induce scindarea ARNt, iar aceste fragmente de ARNt servesc ca ARN-uri mici care interferează, care reglementează activitatea. factorului de traducere.