O cale pentru utilizarea fructozei de către Escherichia coli care implică regulamentul fucozei PNAS

Contribuit de Hans Kornberg, 25 octombrie 2006 (primit pentru revizuire 17 octombrie 2006)

pentru

Abstract

Fructoza poate fi preluată de Escherichia coli printr-o varietate de proteine ​​care acoperă membrana și recunosc zaharurile cu configurația 3,4,5-d-arabino-hexoză. Aici, descriem un mutant lipsit de aceste proteine, dar care preia fructoză prin intermediul purtătorului FucP utilizat în mod normal pentru transportul α-l -fucozei; aceasta implică faptul că fructoza este preluată sub forma α- sau β-fructopiranoză. Pentru creștere, fructoza asimilată este fosforilată secvențial de ATP și (i) manno (fructo) kinază, pentru a forma fructoză 6-fosfat și (ii) fosfofructokinază, pentru a forma fructoză 1,6-bisfosfat, care este un membru al căilor centrale de glicoliză și gluconeogeneză. Mutația care conferă organismului capacitatea de a prelua fructoză prin regulamentul fucozei a fost localizată ca o deleție a genei fucA cu inducerea consecventă a transportorului de fucoză legat de protoni, FucP.

Am descris anterior (1) proprietățile unui mutant de Escherichia coli desemnat HK 2148 care este capabil să crească pe fructoză ca singură sursă de carbon, în ciuda inactivării tuturor căilor cunoscute care implică sistemul fosfoenolpiruvat/glicoză fosfotranferază (PT) pentru absorbția și utilizarea acestei cetoză (2). Intrarea fructozei în această tulpină se realizează prin difuzarea facilitată a acesteia printr-o izoformă a transportorului de glucoză normal legat de PT, PtsG, care necesită, prin urmare, să se asigure concentrații relativ mari de fructoză în mediu (Km pentru creștere = ≈8 mM) . Așa cum ar fi de așteptat din acest mod de absorbție a fructozei, creșterea pe acest substrat este puternic inhibată de analogii glucozei, cum ar fi metil-α-d-glucozidă (αMG). Cu toate acestea, culturile de HK 2148 expuse timp de câteva zile la 37 ° până la 20 mM fructoză plus 1 mM αMG au dat naștere la mutanți suplimentari, dintre care unii nu au fost doar impermeabili la prezența αMG atunci când au crescut pe fructoză, dar au crescut pe această cetoză la concentrații mult mai mic (Km pentru creștere 14 C) Fructoză de HK 2298.

În timp ce suspensiile de HK 2298 cultivate cu LB au preluat cu ușurință și au încorporat 14 C din [14 C] fructoză la concentrații de până la 0,1 mM, suspensii similare de HK 2148 au făcut acest lucru doar într-o măsură neglijabilă (datele nu sunt prezentate). Nici PtsG, nici proteinele specificate de operonul fructozei legate de PT nu au fost implicate în această absorbție: un derivat al HK 2298 care transporta și ptsG: kanR (tulpina HK 2385) a crescut pe fructoză și a preluat această cetoză la rate care nu se disting de HK 2298, la fel ca și alți derivați ai HK 2298 care poartă fie fruA: kanR (tulpina HK 2578), fie o deleție care acoperă regiunea promotoră a operonului fructozei, precum și fruB și fruK (tulpina HK 2544).

Localizarea genului responsabil pentru captarea fructozei.

Pentru a evita posibilele erori datorate introducerii operonului de fructoză legat de PT, un număr de tulpini Hfr de E. coli care transferă ADN din diferite puncte de origine și în direcții diferite și care transportă transpozonul Tn10 în siturile cunoscute (3) au fost încrucișate cu tulpina HK 2578, un derivat al HK 2298 în care activitatea FruA a fost ștearsă prin introducerea fruA: kanR; toți exconjuganții au fost testați pentru reținerea markerului kanR. Aceste colonii rezistente la tetraciclină au fost examinate pentru pierderea capacității lor de a crește pe fructoză 2,5 mM. Am constatat că tulpina Hfr BW6169, care poartă argA: Tn10 situată la minutul 63.5 pe harta de legătură E. coli (4) și își transferă ADN-ul în sens invers acelor de ceasornic de la aproximativ minutul 84.8, a dat naștere coloniilor rezistente la tetraciclină, dintre care 40% nu a reușit să crească pe fructoză și care a luat, de asemenea, 0,5 mM [14 C] fructoză la o rată neglijabilă. Acest rezultat a plasat sistemul presupus de captare a fructozei într-un loc apropiat de argA. Această locație (5) a fost definită mai precis prin transducția HK 2578 cu fagii care transportă fucP: Tn10, o ștergere a genei care specifică transportul de fucoză legat de protoni, care este situat la min 63.2. Niciunul dintre cei 116 transductanți obținuți nu a crescut sau a preluat fructoză.

Identitatea sistemului de absorbție a fructozei cu o componentă a regulii fucozei (6) a fost investigată cu doi transductanți argA: Tn10 din cruce [fagul P1 crescut pe BW6169 × HK 2578], unul (HK 2621) care și-a păstrat capacitatea de a cresc pe fructoză și cealaltă (HK 2622) fiind printre cei 40% care o pierduseră. Am observat că absorbția de 0,5 mM [14 C] fructoză de HK 2621 crescut cu LB a fost puternic inhibată de 0,1 mM-α- l - (-) - fucoză, dar nu de d - (+) - fucoză (Fig. 1A) . HK 2622 a preluat fructoza marcată la l - (-) - fucoză (Fig. 1B).

Efectul α-l-glucozei asupra absorbției de 0,5 mM [14 C] fructoză. (A) Tulpina HK 2621 (Fuc-F +) care ia [14 C] fructoză singură (○) și în prezența d - (+) - fucozei (▴) sau a l - (-) - fucozei (●) . (B) Tulpina HK 2622 (Fuc-F -) luând [14 C] fructoză singură (○) și în prezența l - (-) - fucoză (●). Notă diferența de scară.

Mai mult, suspensiile de HK 2621 crescute cu LB au preluat într-o măsură semnificativă α- l - [3 H] fucoză, în timp ce suspensiile similare de HK 2622 nu (Fig. 2).

Preluarea de 0,5 mM [3 H] fucoză prin tulpina HK 2621 (Fuc-F +) (○) și prin tulpina HK 2622 (Fuc-F -) (■).

Această absorbție de către HK 2621 (și de către părintele său, HK 2578) s-a produs rapid în primele câteva minute de expunere la izotop și apoi a crescut doar într-o mică măsură, ceea ce a indicat că fucoza preluată nu a mai fost metabolizată în continuare. În acord cu această interpretare, am observat că nici o tulpină, HK 2578 și HK 2621, nu a crescut pe α-l-glucoză, în timp ce părinții lor cu fructoză negativă HK 2148 și HK 2632 nu au crescut. Mai mult, în plus față de 1 mM-α- l -fucoză la culturile de HK 2578, creșterea pe 1-10 mM fructoză a împiedicat în mare măsură creșterea, cu cinetica care indică inhibarea competitivă (Fig. 3); întrucât adăugarea de α-l-glucoză la culturile de HK 2632 crescând pe 5-20 mM fructoză nu a avut un astfel de efect (datele nu sunt prezentate).