Manipularea activității mitocondriilor în linia celulară hepatică umană Huh7 prin laser cu putere redusă
Anna Lynnyk
1 Institutul de Fizică al Academiei Cehe de Științe, Praga, 18221, Republica Cehă
Maria Lunova
1 Institutul de Fizică al Academiei Cehe de Științe, Praga, 18221, Republica Cehă
2 Institutul de Medicină Clinică și Experimentală (IKEM), Praga, 14021, Republica Cehă
Milan Jirsa
2 Institutul de Medicină Clinică și Experimentală (IKEM), Praga, 14021, Republica Cehă
Daria Egorova
3 Universitatea ITMO, St. Petersburg, 197101, Rusia
Andrei Kulikov
3 Universitatea ITMO, St. Petersburg, 197101, Rusia
Šárka Kubinová
1 Institutul de Fizică al Academiei Cehe de Științe, Praga, 18221, Republica Cehă
4 Institutul de Medicină Experimentală din Academia Cehă de Științe, Praga, 14220, Republica Cehă
Oleg Lunov
1 Institutul de Fizică al Academiei Cehe de Științe, Praga, 18221, Republica Cehă
Alexandr Dejneka
1 Institutul de Fizică al Academiei Cehe de Științe, Praga, 18221, Republica Cehă
Abstract
Iradierea cu lumină roșie cu laser de mică putere a fost recunoscută ca un instrument promițător într-o mare varietate de aplicații biomedicale. Cu toate acestea, o înțelegere profundă a mecanismelor moleculare din spatele efectelor celulare induse de laser rămâne o provocare semnificativă. Aici, am investigat mecanismele implicate în procesul morții în linia celulară hepatică umană Huh7 la o iradiere cu laser. Am decuplat căi distincte de moarte celulară vizate de iradieri cu laser de diferite puteri. Datele noastre demonstrează că iradierea cu doză mare a laserului a prezentat cele mai ridicate niveluri de producție totală de specii reactive de oxigen, ducând la necroza asociată ciclofilinei D prin tranziția permeabilității mitocondriale. Dimpotrivă, iradierea cu doză mică a laserului a dus la acumularea nucleară de superoxid și execuția apoptozei. Descoperirile noastre oferă o nouă perspectivă asupra răspunsurilor celulare induse de laser și dezvăluie căi distincte de moarte celulară declanșate de iradierea cu laser. Legătura observată între depolarizarea mitocondriilor și declanșarea ROS ar putea fi un fenomen fundamental în răspunsurile celulare induse de laser.
1. Introducere
2. Materiale și metode
Proiectarea și caracterizarea sistemului laser
Caracterizarea sistemului laser. (A) Configurare experimentală. (B) Schema sistemului laser. LD - diode laser. (C) Divergența fasciculului laser.
Cultură de celule
Linia celulară de carcinom hepatocelular uman Huh7 obținută din Colecția Japoneză de Bioresurse de Cercetare (JCRB) au fost cultivate în mediu EMEM (American Type Culture Collection, ATCC) suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (FCS) conform recomandărilor furnizorului. Culturile au fost păstrate într-o atmosferă umidificată de 5% CO2 la 37 ° C și mediul a fost schimbat de două ori pe săptămână.
Tratamentul cu laser
Celulele Huh7 au fost însămânțate în vase de 35 mm pentru culturi de țesuturi IBIDI (IBIDI, München, Germania) cu 24 de ore înainte de iradierea cu laser. În funcție de experiment, celulele au fost etichetate fie înainte de iradiere cu laser, fie imediat după. Poziționarea conectorilor optici în cea mai apropiată celulă a fost efectuată utilizând un micromanipulator Eppendorf (5171, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germania) care a fost conectat la un microscop Nikon Diaphot 200 (Nikon, Tokyo, Japonia) (Fig. 1 (A )). Conectorii optici au fost sterilizați cu etanol 75% înainte de poziționarea către celule.
Produse chimice
Au fost utilizate următoarele sonde fluorescente: ROS Cellular/Superoxide Detection Assay Kit (Abcam, Cambridge, Marea Britanie) pentru a detecta generarea de ROS și superoxid; și acetoximetilester de calceină (calceină-AM, 1 μM) și homidimer de etidiu (EthD-1, 4 μM) pentru a monitoriza viabilitatea celulară; JC-1 (2 μM) pentru a monitoriza potențialul membranei mitocondriale și VAD-FMK conjugat la FITC (FITC-VAD-FMK) pentru a detecta activarea caspazei-3. Calcein-AM, homodimerul de etidiu și sondele JC-1 au fost achiziționate de la Thermo Fisher Scientific. Kit-ul de testare celular ROS/Superoxide Detection Assay și FITC-VAD-FMK au fost achiziționate de la Abcam. Pentru a investiga în mod specific ROS mitocondrial, celulele au fost încărcate cu roșu MitoTracker CM-H2XRos (formă redusă de roșu MitoTracker; 0,5 μM; Thermo Fisher Scientific) prin incubarea lor timp de 15 minute. Pata de acid nucleic fluorescent verde SYTO 13 cu permeabilitate celulară (5 μM; Thermo Fisher Scientific) a fost utilizată pentru a marca nucleul. Timpul optim de incubație pentru fiecare sondă a fost determinat experimental.
Au fost utilizați următorii reactivi: ciclosporina A (CsA, 10 uM) pentru a inhiba tranziția permeabilității mitocondriale; necrostatină-1 (Nec-1, 10 uM) ca inhibitor puternic și selectiv al necroptozei; N-acetil-L-cisteină (NAC, 5 mM) pentru eliminarea ROS; staurosporină (STS, 2 μM) ca inductor cunoscut al apoptozei; piocianină (200 μM) ca inductor cunoscut al ROS. Necrostatina-1, ciclosporina A și N-acetil-L-cisteina au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich. Staurosporina și piocianina au fost cumpărate de la Abcam. CellMask Deep Red achiziționat de la Thermo Fisher Scientific a fost utilizat pentru colorarea membranei plasmatice.
Măsurarea viabilității celulare
Viabilitatea celulei a fost analizată prin trusă fluorescentă de testare a celulelor vii/moarte (Thermo Fisher Scientific). Acest test de viabilitate a celulelor de fluorescență în două culori se bazează pe capacitatea calceinei AM de a fi reținută în celulele vii, inducând o fluorescență verde uniformă intensă și EthD-1 pentru a lega nucleele celulelor deteriorate, producând astfel o fluorescență roșie aprinsă în celulele moarte. [29]. Pentru analiza cursului temporizat, celulele Huh7 au fost însămânțate în vase de 35 mm de cultură de țesuturi IBIDI (IBIDI, München, Germania) cu 24 de ore înainte de etichetare. Celulele au fost colorate cu calceină-AM (1 μM) și EthD-1 (4 μM) timp de 30 de minute. După marcare, celulele au fost expuse la lumina laserului. Ulterior, imaginile au fost capturate folosind microscopul confocal cu scanare laser Bio-Rad MRC-1024 (Bio-Rad, Cambridge, MA) timp de 50 de minute cu un interval de 2 minute între imagini. Software-ul ImageJ (NIH) a fost utilizat pentru procesarea imaginilor. Intensitatea fluorescenței ambelor coloranți a fost măsurată la punctele de timp respective și a fost normalizată la fluorescența totală la 30 de minute după încărcarea colorantului. Pentru a confirma validitatea colorării vii/moarte au fost, de asemenea, tratați cu etanol 10% timp de 10 min și imagistica ulterioară (datele nu sunt prezentate).
Detectarea speciilor de oxigen reactiv intracelular (ROS)
Testul apoptozei
Apoptoza a fost evaluată prin colorarea anexinei V/iodură de propidiu. Celulele au fost tratate cu diferite fluențe de iradiere a laserului timp de 40 de minute. Expresia fosfatidilserinei, ca semn precoce al apoptozei, a fost determinată prin analiza microscopică cu fluorescență prin legarea anexinei V marcată cu izotiocianat de fluoresceină (Sigma-Aldrich); iodura de propidiu (PI) a fost utilizată pentru a diferenția celulele necrotice. NucRed a fost folosit ca colorare nucleară (Thermo Fisher Scientific). Imaginile de fluorescență au fost înregistrate folosind un microscop confocal cu scanare laser Bio-Rad MRC-1024 (Bio-Rad, Cambridge, MA). Software-ul ImageJ (NIH, Bethesda, MD) a fost utilizat pentru procesarea imaginilor și cuantificarea micrografiei fluorescente. Fluorescența PI și anexina V au fost calculate prin normalizarea fluorescenței celulare totale corectate (CTCF) din întreaga zonă de interes până la fluorescența medie a regiunii. Intensitatea medie CTCF netă a unui pixel din regiunea de interes a fost calculată pentru fiecare imagine utilizând o metodă descrisă anterior [35].