Macrofagele protejează împotriva atrofiei musculare și promovează recuperarea musculară in vivo și in vitro

Nicolas Dumont

De la Centre Hospitalier Universitaire de Quebec - Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université Laval, * și Département de Réadaptation, † Faculté de Médecine, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada

Jérôme Frenette

Abstract

Monocitele sunt celule mononucleare mari care circulă în sânge și se diferențiază în macrofage în țesuturile invadate ca răspuns la diferiți stimuli. 1 Macrofagele au o capacitate fagocitară puternică și pot orchestra procesul inflamator prin eliberarea unei largi varietăți de citokine și chemokine, cum ar fi interleukina (IL) -1, factorul de necroză tumorală-α și proteina inflamatorie a macrofagelor-2. 2, 3 Numeroase studii au demonstrat, de asemenea, că macrofagele joacă un rol direct în recuperarea țesuturilor prin eliberarea de molecule antiinflamatorii și factori de creștere anabolici IL-10, factor de bază de creștere a fibroblastelor și factor de creștere asemănător insulinei (IGF-1) ). 4, 5, 6

În studiul de față, șoarecii săraci în macrofage au fost supuși descărcării și reîncărcării membrelor posterioare pentru a evalua rolul macrofagelor în atrofia și regresul muscular. Rezultatele noastre au arătat că macrofagele nu previn pierderea forței musculare și nici nu favorizează recuperarea în timpul fazei inflamatorii timpurii (1 și 3 zile după reîncărcare). Cu toate acestea, ele joacă un rol cheie în creșterea și recuperarea musculară în perioade ulterioare (7 și 14 zile după reîncărcare). În plus, un model de cocultură in vitro în care miotuburile atrofiate au fost combinate cu macrofage care exprimă un fenotip antiinflamator a arătat că prezența macrofagelor protejează miotuburile de atrofie și că acest efect protector este parțial mediat de eliberarea IGF-1.

Materiale și metode

Animale

Șoarecilor masculi C57BL/6 (22 până la 24 g) de la Charles River (St-Constant, QC, Canada) li s-a dat apă și alimente ad libitum și au fost adăpostiți cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Șoarecii experimentali au fost supuși descărcării membrelor posterioare timp de 10 zile folosind o modificare a tehnicii dezvoltate de Morey-Holton și Globus. 17 Membrele posterioare au fost apoi reîncărcate timp de 0, 3, 7 sau 14 zile. Șoarecii ambulatori au fost folosiți ca martori. Șoarecii au fost eutanasiați prin luxație cervicală sub anestezie. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Centrului de cercetare universitar Laval, pe baza ghidurilor Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor.

Epuizarea monocitelor/macrofagelor

Pentru a determina rolurile specifice ale monocitelor/macrofagelor în recuperarea musculară după atrofie, etopozidul (VP-16, Sigma, St. Louis, MO) diluat în dimetil sulfoxid (15 mg/kg de masă de șoarece) a fost injectat zilnic timp de 3 zile înainte de reîncărcare până la sfârșitul protocolului experimental. Etopozidul acționează ca un inhibitor al topoizomerazei II și este utilizat în tratamentul unor afecțiuni maligne, cum ar fi leucemia nelimfocitară, pentru a inhiba proliferarea celulelor albe din sânge. 18 șoareci placebo au primit zilnic injecții de dimetil sulfoxid. Efectele etopozidului asupra numărului de leucocite au fost confirmate prin citometrie în flux așa cum s-a descris anterior. 14 Pe scurt, sângele a fost colectat prin puncție cardiacă, incubat cu IgG de șobolan blocant (Sigma) și marcat cu 0,2 mg de șobolan anti-șoarece Ly-6G anticorp conjugat R-ficoeritrin sau 0,4 mg de șobolan anti-șoarece F4/80 Anticorpi conjugați cu R-ficoeritrin (anticorpi primari, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) pentru a detecta neutrofilele și respectiv macrofagele. IgG anti-șoarece de șobolan conjugat cu R-ficoeritrină a fost utilizat ca anticorp martor izotip la aceleași concentrații (BD Pharmingen). Citometria de flux a fost efectuată folosind un citometru de flux EPICS XL (Beckman-Coulter, Fullerton, CA).

Proprietăți contractile izometrice

Șoarecii au fost injectați i.p. cu buprenorfină (0,1 mg/kg) ca analgezic și anesteziat cu pentobarbital sodic (50 mg/kg) 15 minute mai târziu. 19 Mușchii solei drepți au fost disecați cu atenție, atașați la un electrod și incubați într-o soluție de sare fiziologică tamponată (Krebs-Ringer) suplimentată cu glucoză (2 mg/ml) pentru măsurători absolute și specifice ale forței musculare, așa cum a fost descris anterior. 14, 20 Forța musculară absolută reprezintă forța totală generată de mușchi, în timp ce forța musculară specifică contează și masa musculară și lungimea fibrelor. Ulterior, lungimea mușchilor a fost măsurată, tendoanele au fost îndepărtate și mușchii au fost cântăriți. Mușchii au fost apoi încorporați în mediu de înghețare a țesuturilor (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC), înghețat în izopentan (2-metilbutan, Sigma) răcit în azot lichid și depozitat la -80 ° C până la utilizare.